Micromachines | 肿瘤细胞耐药性分析：“单细胞微阵列芯片” 与 “肽核酸-DNA探针” 联合技术

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单细胞分析是帮助理解各种疾病复杂生物学特征及协助诊断的有力手段。细胞微阵列芯片技术在当前的单细胞分析中发挥着不可取代的作用，其可以结合荧光标记抗体或荧光标记DNA探针技术用于筛选和分析靶细胞。但是，面对表达量很小的蛋白质或少数核苷酸突变的基因，这些探针技术在灵敏度和特异性方面表现出了一定的局限性和不足，特别在单细胞水平上，这种局限性表现得尤其明显。

图片来源：Unsplash

近期，日本产业技术综合研究所 (AIST) 的Shohei Yamamura教授及其团队在期刊Micromachines上发表了一篇题为“Analysis of Single Nucleotide-Mutated Single-Cancer Cells Using the Combined Technologies of Single-Cell Microarray Chips and Peptide Nucleic Acid-DNA Probes”的文章，提出采用单细胞微阵列芯片结合肽核酸-DNA探针技术，成功从多个未突变的癌细胞中检测并分离出表达单个核苷酸突变的mRNA的单细胞，从而为单细胞分析开辟了新的途径。

实验设计

总体设计思路

将T790M突变的肺癌细胞系 (NCI-H1975) 作为抗癌耐药性癌细胞的模型掺入到非突变的癌细胞 (A549) 中，使用单细胞芯片结合新型的PNA-DNA探针技术将目标T790M突变的癌细胞 (NCI-H1975) 与未突变的癌细胞 (A549) 区分开。

单细胞微阵列芯片的构建：单细胞微阵列芯片采用聚苯乙烯制作，使用的是日本千叶精工机研株式会社设计的UV-LIGA (ultraviolet-lithographie galvanoformung abformung) 工艺 (图1a)。采用UV光刻技术制作图案化的光致抗蚀剂基板后，通过电铸工艺产生具有微结构的镍模具；然后采用注射成型法在镍模具中注射聚苯乙烯，形成微阵列芯片。每个微阵列芯片由10个大小不同的簇组成，每个簇包含6241个 (79×79) 微腔，每个微腔均具有圆锥台的形状，并且能够容纳细胞。

PNA-DNA探针的构建：将结合异硫氰酸荧光素 (FITC) 的PNA (FITC-PNA) 和与淬灭剂结合的DNA (Q-DNA) 杂交构建PNA-DNA探针。具体的说，是将FITC-PNA和Q-DNA在PBS溶液中混合并用退火程序自组装；将混合的试剂在95℃加热5分钟以使其变性；之后温度以每分钟-1.38°C的速率逐渐降低至30℃；最后，将混合物在30℃下孵育10分钟并保持在10℃下，即得到PNA-DNA探针产物。

图1. 分析单个核苷酸突变的癌细胞的示意图。(a) 是单细胞微阵列芯片设备的真实照片，该微阵列芯片由62,410个微腔组成 (上直径：31-40 µm，下直径：11-20 µm，深度：28 µm，间距：100 µm)；(b) 是单细胞微阵列芯片中一个簇的微腔 (上直径：32 µm，下直径：12 µm) 的显微图像，图片显示每个微腔均容纳一个肺癌细胞；(c) 是用肽核酸 (PNA)-DNA探针检测目标单核苷酸突变的表皮生长因子受体 (EGFR) mRNA的原理；(d) 使用单细胞微阵列芯片结合PNA-DNA探针在单细胞水平上分析突变型癌细胞的示意图。

图2. 单细胞微阵列芯片上不同肺癌细胞系 (NCI-H1975和A549) 的分离和分析。

在图2中，上下图分别显示了NCI-H1975 (T790M突变) 和A549 (非突变) 细胞的代表性荧光图像，分别用稀释的4,6-联脒-2-苯基吲哚 (DAPI；蓝色)、异硫氰酸荧光素染色 (FITC) 偶联的肽核酸 (PNA)-DNA探针 (绿色) 和藻红蛋白 (PE) 标记的细胞角蛋白 (CK) 抗体 (红色)。

实验结果

因为NCI-H1975细胞的荧光强度是阴性对照 (A549) 细胞的两倍，所以可以在单细胞微阵列芯片上对携带突变的癌细胞进行染色和区分。由于A549的最大荧光强度约为80–100，因此本研究中荧光强度大于100的细胞被分类为阳性 (NCI-H1975) 细胞，而荧光强度小于或等于100的细胞被分类作为A549细胞。NCI-H1975和A549细胞系的荧光强度差异足以在荧光显微镜结合PNA-DNA探针技术的单细胞微阵列芯片中进行区分。因此，这些结果强烈表明可以实现单核苷酸突变的癌单细胞的成像分析。

此外，细胞通过芯片上的DAPI、CK和PNA-DNA探针染色，将所有癌单细胞 (突变和非突变) 填充到单细胞微阵列芯片上50-60％的微腔室中，而不会在洗涤过程从微腔室中移出细胞。在洗涤过程之后，两种类型的肺癌细胞以相同的方式分离成单细胞。因此在单细胞微阵列芯片上分散前后，细胞样品的掺入比例没有变化，这表明已经在单细胞微阵列芯片上实现了单细胞水平的多次染色。

这种结合了单细胞微阵列芯片和PNA-DNA探针系统的技术可以成为分析癌组织中少量含单核苷酸突变的癌细胞的有用工具。这些细胞是在抗癌药物治疗前后通过活检收集的，通过将PNA-DNA探针的序列改变为各种靶突变，可以在单细胞水平上检测多个基因突变的癌细胞并有效地选择抗癌剂。单细胞微阵列芯片系统的另一个优点是能够回收靶单细胞。最近，在手术前进行微创诊断的需求十分强烈，靶向血液中循环肿瘤细胞 (CTC) 或循环肿瘤DNA (ctDNA) 的液体活检是转移性癌的有潜力的诊断方法，也是本文所提技术的主要应用领域。

Micromachines (ISSN 2072-666X; IF 2.523) 是一个与微纳米技术领域相关的国际型开放获取期刊。其期刊范围涵盖微纳米结构、材料、设备和系统等各方面的研究与应用。Micromachines采取单盲同行评审，一审周期约为12.6天，文章从接收到发表仅需1.9天。

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原文出自Micromachines期刊

Shigeto, H.; Yamada, E.; Kitamatsu, M.; Ohtsuki, T.; Iizuka, A.; Akiyama, Y.; Yamamura, S.Analysis of Single Nucleotide-Mutated Single-Cancer Cells Using the Combined Technologies of Single-Cell Microarray Chips and Peptide Nucleic Acid-DNA Probes. Micromachines 2020, 11, 628.

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*翻译作者：Miska Guo

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