MDPI Viruses | 期刊作者荣获诺贝尔生理学或医学奖：丙肝病毒发现者—如何能“看到”丙肝病毒？

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2020诺贝尔获奖者之一—Charles M. Rice

2020诺贝尔生理学或医学奖获奖者之一Charles M. Rice，于2019在MDPI Viruses期刊发表了题为"Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus"的文章，以表征的方式探究了丙肝病毒复制的本质以及抗病毒药物作用机理[4]。

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Liu, D. et al. Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus. Viruses 2019, 11, 1039.

丙肝病毒

丙肝病毒是RNA病毒。RNA病毒是一个大家族，除了导致这次全球疫情的新冠病毒(COVID-19)，还有艾滋病毒、埃博拉病毒、流感病毒和寨卡病毒等。相对于DNA病毒，RNA病毒具有较高的变异性。因其起到修正机能RNA聚合酶的活性很低[1]，新的基因突变会不断产生，并使其迅速适应变化的环境。如图1所示，RNA病毒可分类为单链RNA (ssRNA) 病毒和双链RNA (dsRNA) 病毒。上面提到的所有病毒均为单链RNA病毒。单链RNA病毒可以进一步分为正单链RNA病毒 (positive-sense single-stranded RNA virus, (+) ssRNA virus) 和负单链RNA病毒 (negative-sense single-stranded RNA virus, (+) ssRNA virus) [2] 。

图1. RNA病毒分类及其复制过程。(图片来源：Wikipedia)

丙肝病毒于80年代被发现，是一种正单链RNA病毒，它在进入宿主细胞后，部分可以作为信使RNA (mRNA) 直接参与指导蛋白质合成 [3]。另一部分正链RNA可以通过依赖RNA的RNA聚合酶 (RDRP)，生成负链RNA，从而形成双链形式的复制型中间体。再以负链RNA为模板，在RNA聚合酶的作用下，生成新的正链RNA，达到复制的目的。

在本文中，针对正链和负链RNA及它们之间的互相作用，借助了分支DNA信号扩增荧光原位杂交技术 (Branched DNA In Situ Hybridization, bDNA FISH)，在同一个样品中检测核酸及指定蛋白质特异性信号的直接荧光，实现了同时“看到”丙肝病毒的正/负链RNA。

图2为使用分支DNA与荧光原位杂交技术结合观察到的荧光图像。图2A所示，分别对正单链RNA和负单链RNA染色，通过上下图像对比，若存在丙肝病毒 (HCV) 细胞，绿色的正单链RNA与红色的负单链RNA便会清晰可见。负单链RNA的数量远少于正单链RNA数量。对少量负单链RNA的成功标记，可以体现出该方法的超高灵敏度。并且，由于负单链RNA为病毒复制的中间体，所以对其的标记更有意义。与图2A不同是，图2B在同一样品中先后对正单链RNA与负单链RNA进行染色，染色的顺序对结果没有影响。

图2. (A上) 普通肝细胞；(A下) 受丙肝病毒感染的肝细胞 ；(A左) 染色为绿色的正单链RNA；(A右) 染色为红色的负单链RNA；(B) 在同一样品中对正负单链RNA进行标记；(B左) 先标记正单链RNA；(B右) 先标记负单链RNA)。图上比例尺为1um。

在表征敏感度得到上文的验证后，作者探究了不同的抗丙肝病毒药物对病毒感染细胞及病毒复制过程的影响。此次使用的抗病毒药物为Danoprevir (DNV)、Ledipasvir (LDV)、Daclatasvir (DCV) 和Sofosbuvir (SOF)。将DMSO (二甲基亚砜) 作为实验的空白对照组。按照图3A所示的方法处理细胞，并在图3B中观察每种药物对感染细胞的作用。从实验的结果可知，所有的抗病毒药物都可以抑制病毒的复制。但是，作为DS5A抑制剂的Ledipasvir和Daclatasvir对病毒复制的抑制作用要明显高于作为NS3/4A和NS5B抑制剂的Danoprevir和Sofosbuvir (如图3C和3D)。即时聚合酶链式反应 (real-time PCR) 的定量数据也支持上述的结果 (如图3E)。

图3. (A) 样品处理方法；(B) 不同抗病毒药物及对照组下肝细胞图像；(C) 每个细胞中正负单链RNA病毒颗粒 (foci) 数量；(D) 丙肝病毒RNA荧光强度；(E) 使用即时PCR方法统计正负单链RNA数量。其中C，D，E都是参考对比对照组的相对数量。

由于传统的荧光原位杂交技术的敏感度低，因此很难检测到正单链RNA病毒转译过程中出现的少量负单链RNA。这些负单链RNA尽管数量少，但是可能对病毒的复制起着决定性的作用。所以，对少量负单链RNA的检测，在了解病毒复制的本质和研发相应的抗病毒药物中起着不可或缺的作用。在本文章中使用的分支DNA信号扩增荧光原位杂交技术具有超高的敏感度和选择性，可以指定标注正单链RNA或者负单链RNA，也可以同时标准两种RNA。以此，不但可以阐明负单链RNA所起到的重要作用，也可以深入研究抗病毒药物的作用机理。

参考文献：

1. Adaptive value of high mutation rates of RNA viruses: separating causes from consequences. Journal of virology, 2005, 79(18): 11555-11558

2. Available online: https://en.wikipedia.org/wiki/RNA_virus

3. Available online: https://en.wikipedia.org/wiki/Positive-strand_RNA_virus

4. Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus. Viruses 2019, 11(11), 1039 https://doi.org/10.3390/v11111039

Viruses (ISSN 1999-4915; IF 3.816) 是一个病毒学领域的国际型开放获取期刊。其期刊范围涵盖动物病毒、植物病毒、抗病毒和疫苗、噬菌体以及朊病毒等各方面的研究。Viruses采取单盲同行评审，一审周期约为14.7天，文章从接收到发表仅需2.5天。

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*文案作者：Lin Li

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