单细胞谱系分析重建人类肺末梢祖细胞分化过程

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文章信息

今天要分享的文章是利用单细胞转录组揭示肺泡上皮2型细胞分化过程与轨迹。于2020年1月30日发表在Cell Stem Cell 杂志，文章标题是：Reconstructed Single-Cell Fate Trajectories Define Lineage Plasticity Windows during Differentiation of Human PSC-Derived Distal Lung Progenitors。DOI：https://doi.org/10.1016/j.stem.2019.12.009。

 摘  要 

肺泡上皮2型细胞（AEC2）是在整个生命周期中负责维持肺泡的的兼性祖细胞，但是却很难从患者体内分离获得。本研究，从体外培养的人多能干细胞（PSCs）中提取AEC2s，并用慢病毒条形码的时间序列单细胞RNA测序，主要与胎儿和成人AEC2基准相比，分析它们的分化动力学。当原始肺祖细胞在体外分化时，作者观察到分叉的细胞命运轨迹，其中一些子代达到其AEC2命运目标，而其他子代则转向其他非肺内胚层命运。作者建立了一个连续的状态隐马尔可夫模型，以识别导致一些早期多能NKX2-1+祖细胞丧失肺功能的信号的时间和类型，如过度活化的Wnt反应。最后，他们发现这种初始发育可塑性是可调节的，并且会随着时间而消退，最终导致PSC来源的AEC2表现出稳定的表型和几乎无限的自我更新能力。

测序数据介绍

本文首先进行了 bulk RNA sequencing测序找到肺泡发育的关键时间点，然后进行单细胞的测序；细胞的捕获和建库参考inDrop单细胞测序技术。

数据分析情况

对于数据分析，作者给出了详细的代码：

Data and Code Availability

The data discussed in this publication have been deposited in NCBI’s Gene Expression Omnibus (Edgar et al., 2002) and are accessible through GEO Series accession numbers GSE131768, GSE137799, GSE137805 and GSE137811 and is also available as well on the Kotton Lab’s Bioinformatics Portal at http://www.kottonlab.com. Software for CSHMM is available at: https://github.com/jessica1338/CSHMM-for-time-series-scRNA-Seq and an interactive webtool for the CSHMM of the time series data is publicly accessible online at: http://cosimo.junding.me. SPRING visualizations of the time series data is available in an interactive form at: https://kleintools.hms.harvard.edu/tools/springViewer_1_6_dev.html?cgi-bin/client_datasets/nacho_springplot/allMerged .

主要分群情况

Transcriptomic Profiles of Primary Human Developing Lung Alveolar Epithelium

首先通过bulk RNA-seq确定肺泡上皮2型细胞（AEC2）内体发育过程的转录组动态特征。

Selecting the Most Appropriate Time Points to Profile in a scRNA-Seq Analysis

A Single-Cell Map of PSC-Derived Distal Lung Differentiation Implies Fate Trajectories

Lineage Tracing Using DNA Barcoding Reveals Clonal Heterogeneity and Fate Plasticity

临床意义

为了提高我们对PSC分化协议的理解，我们创建了一个新的框架，它结合了实验设计、计算建模、慢病毒条形码和scRNA序列分析。通过追踪慢病毒条形码亲本的后代可以明显看出，我们的PSC衍生系统中观察到克隆可塑性导致肺和NLE细胞死亡，一项与活体观察结果相似的发现，即在Wnt活性旺盛或Nkx2-1缺失的异常或病变环境中，发育中或成年肺上皮往往恢复为NLE命运。此外，在Nkx2-1表达缺失的情况下，多个肺上皮细胞通过一种涉及Foxa2驱动的非肺命运抑制缺失的机制，在胎儿或成人肺中恢复为NLE命运（Little等人，2019年）（Snyder等人，2013年）。这种来自肺上皮双亲的NLE后代的出现在肺腺癌环境中尤其明显，这表明我们的模型可能为理解和预防肺癌发病过程中发生的命运变化提供帮助。

       我们验证了联合使用scRNA-seq和慢病毒条形码预测的亲子关系的准确性。单个细胞的遗传标记允许在定向分化过程中追踪其后代。单个细胞的遗传标记允许在定向分化过程中追踪其后代。正如最近的报道（Biddy et al.，2018，Wagner et al.，2018），这种方法可以以监督和非监督两种方式匹配血统关系。最后，我们还发现，在我们的模型中，分配到AEC2路径的细胞似乎稳定了其表型，这与包括内胚层血统在内的发育命运的时间依赖性限制的体内模式一致（Grapin Botton，2005）。这就导致了一个可扩展的肺祖细胞池，即使在体外大量增殖后，也能维持稳定的AEC2样命运。

       我们的工作提供了有关人类肺发育的见解，包括进一步评估在最初的人类肺规范中，Wnt通路的早期调节在确定AEC2命运中的作用，以及CEBPδ的识别及鉴定CEBPδ（以前已知在小鼠AEC2分化中发挥作用）在人类发展中的AEC2分化此外，我们的工作还确定了在肺部受精后出现的命运可塑性时期，表现为保留的内胚层多能性，随着时间的流逝而逐渐消退，从而使以后的细胞能够更好地保持命运的稳定性。我们的结果为广泛存在的PSC定向分化导致异质谱系的形成提供了机制解释，这些谱系在存在有效生长因子的情况下很难保持稳定。在将来的研究中，可能需要通过精确的时空控制对生长因子剂量反应进行更复杂的调节，以便在从PSCs中提取肺细胞用于未来的再生医学应用时，适当地稳定和控制细胞的命运、纯度和成熟度。本文描述的计算框架在更广泛的干细胞生物学社区中有多种实际应用，可通过STAR方法中详述的开放源代码和Web可视化引擎进行访问。因此，我们的方法可以用于分析scRNA-seq时间序列数据集，尤其是那些专注于分化干细胞的数据集。不同于以往大多数从scRNA序列数据重建轨迹的方法，CSHMM使用概率模型，利用所有基因推断细胞分配和分枝，从而克服噪声和内部随机性，这两个都是干细胞数据的特征。

      值得强调的是方法的某些局限性。虽然我们在对祖细胞进行分类后尽可能早地对细胞进行采样，但在对肺祖细胞标记物NKX2-1进行分类前，或使用表观遗传分析方法，早期收集内胚层样本，可以识别在我们的转录组学分析中可能遗漏的某些细胞命运预测的模式。其次，我们的方法旨在检测多能性和命运分歧，而不是量化每个发育阶段可能存在的谱系偏倚。随着时间的推移，其他人已经发表了慢病毒条形码，可用于更精确地量化我们方案中每个阶段的谱系偏倚。应该指出的是，先前的时间序列图谱已经揭示了在不同的胚层衍生物的发展中可以检测到来自不同起源的命运趋同；但是，我们发现在肺部发育轨迹中仅存在分歧，这表明收敛可能不会促进AEC2的出现。这些结果与先前的观察结果一致，即所有远端肺上皮细胞后代均通过内胚层NKX2-1 +祖细胞的通路产生，而不是来自其他来源。

       尽管存在诸多不足，我们建立的将预测性计算方法与细胞命运追踪相结合的框架是可以推广的。可以用来进一步理解和模拟其他几种定向分化策略和疾病的发病机制，并有可能引导未来的细胞治疗的发展。

(本文通讯作者Kotton Lab http://www.bumc.bu.edu/kottonlab/)

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