溃疡性结肠炎患者的细胞内和细胞间重排
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摘 要
全基因组关联研究（GWAS）揭示了溃疡性结肠炎（UC）的风险等位基因。为了了解它们的细胞类型特异性和作用途径，研究者从18个UC患者和12个健康个体的结肠粘膜中生成了366,650个细胞的图集，揭示了51个上皮，基质和免疫细胞亚群，包括BEST4 +肠上皮细胞（微折叠样）细胞和IL13RA2 + IL11 +炎性成纤维细胞，这与抗肿瘤坏死因子（TNF）治疗的抗性有关。共表达CD8和IL-17的炎性成纤维细胞，炎性单核细胞，微褶样细胞和T细胞会随疾病而扩展，形成细胞间相互作用的枢纽。许多UC风险基因是基于特定细胞类型的，并且在相对较少的基因模块中受到共同调节，这表明它们在有限类型的细胞类型和通路途径上是趋同的。使用此观察结果，研究者提名并推断了GWAS基因座中特定风险基因的功能。此工作提供的作用网络，可用于将人类复杂疾病和对应风险变异映射到细胞类型和通路。
样品
病人和组织样本：
活检样本取自CD患者、溃疡性结肠炎UC患者和健康个体，均在马萨诸塞州总医院(PRISM:2004P001067)炎症性肠病研究的前瞻性注册的知情同意和批准后获得。样本的临床信息和元数据见表S1。在常规结肠镜检查时招募健康对照者。健康对照组为无炎症性肠病(IBD)史、1级IBD亲属、自身免疫性疾病史、免疫介导性疾病史、感染性结肠炎、结肠癌或结肠癌家族史、总体健康、无其他疾病史的个体(表S1)。根据临床对溃疡性结肠炎的诊断，纳入UC患者，并通过内窥镜检查时内科医生的宏观评估观察到有活动性疾病。在内窥镜检查过程中，使用标准护理中使用的活检钳进行了两次活检。每个病人的活组织切片都是在医生确定的区域内采集的。健康的人有两处内窥镜检查正常的组织，而UC患者有(1)一处非炎症和一处炎症区域活检(15例患者;表S1)或两个相邻的非炎症和两个相邻的炎症活检，以考虑患者内部的变异性(3例患者;表S1)。活组织切片立即放入装有先进DMEM F-12的低温瓶中，并置于冰上运输。对于scRNA-seq，所有的活检样本均来自UC患者和健康个体，包括男性和女性(表S1)，年龄跨度为20 - 77岁。对于人类椭球体培养，活检样本来自IBD患者(2例CD患者(右结肠，男性和不吸烟者)和UC患者(右结肠，女性和不吸烟者))
测序
Droplet-based scRNA-Seq
按照制造商的建议，通过GemCode单细胞平台处理细胞，使用GemCode凝胶珠、芯片和文库试剂盒(V1)，或者将单细胞悬浮液按照制造商的单细胞3‘文库协议(V2和V3)加载到3’文库芯片上(10X Genomics ;PN 120233)。采用细胞裂解和RNA的条码逆转录，然后扩增、剪切(对V1)或酶破碎(对V2和V3)和50个转接器和样品索引连接，将单个细胞分割成凝胶珠粒(在GemCode或Chromium仪器中)。每个切片要两个渠道的测序10 x GemCode或 Chromium单一细胞平台,一个用于上皮部分,另一个用于固有层分数为了恢复足够数量的上皮和固有层细胞为下游分析。将6,000个单细胞的输入加入到每个通道中，回收率约为2,000个细胞。文库在Illumina Nextseq或Hi-Seq上进行排序。
SMART-Seq2 for sequencing of human colon spheroids
SMART-Seq2用于人类结肠椭球体库的测序，使用之前报道的修改后的SMART-Seq2协议(Picelli et al.， 2014)。使用RNAClean XP beads [agt]进行RNA裂解物清除，然后使用Maxima逆转录酶[Life Technologies]进行反转录，使用KAPA HotStart HIFI 2 3 ReadyMix [KAPA Biosystems]进行全转录扩增(WTA)，共16个周期。使用Ampure XP beads [Beckman Coulter]纯化WTA产品，使用Qubit dsDNA HS Assay Kit [ThermoFisher]进行定量，使用高灵敏度DNA芯片[Agilent]进行检测。利用Nextera XT DNA文库制备试剂盒从纯化的WTA产物中构建RNA-Seq文库[Illumina, FC-131-1096]。使用相同的方法处理群体和无细胞对照。这些文库是根据Illumina MiSeq软件进行排序的
数据分析
Processing FASTQ reads into gene expression matrices
Cell Ranger v2.0 ，hg19 human
250<每个细胞的表达基因数，UMI计数按每个细胞的总UMIs数和归一化
转换为每10,000个转录数(即“TP10K”)
Cell clustering overview
为了将单个细胞聚类成不同的细胞亚群，研究者们遵循了Haber等人(2017)提出的常规程序，并进行了额外的修改。该工作流程包括以下步骤:将细胞划分为上皮细胞、基质细胞和免疫细胞，然后将细胞聚类到每个细胞群中，这包括“可变”基因的选择、批量校正、降维(PCA)和图聚类。
细胞分群marker
所有样本中的细胞子集比例
Epithelial cell differentiation
使用：Scanpy v0.4.2
51个亚群包括15个上皮亚群，沿着肠干细胞(ISCs)向成熟细胞的分化轨迹排列
Differential expression analysis
利用MAST
虽然大多数成纤维细胞亚群存在于健康个体和UC患者中，但称之为炎症相关成纤维细胞(IAFs)的亚群在一些患者的炎症组织中表达扩大了189倍
Enrich
IAFs富含许多与结肠炎、纤维化和癌症相关的基因，包括IL11、IL24和IL13RA2。白细胞介素-11 (IL-11)是小鼠和潜在人类纤维化的调节因子。IAFs包括WNT2B+和WNT5B+亚群(图S3E)，这表明它们可能反映了一种沿隐绒毛轴的不同状态。IAFs表达癌相关成纤维细胞(CAFs)的标记物，包括FAP、TWIST1和WNT2
多个成纤维细胞亚群在WNT/骨形态发生蛋白(BMP)信号基因的表达上存在差异，可能反映了沿隐绒毛轴对称的不同位置，其中WNT2B、WNT4和DKK3富集，说明它们位于隐窝附近，而其他的则富集于BMP4、BMP5和WNT5A/B，可能位于绒毛附近。这些基因中有许多是上皮下细胞的标记物，这是一种罕见的支持上皮细胞的成纤维细胞群(Shoshkes-Carmel et al.， 2018);然而，在此分析的数据中，它们广泛分布在所有子集(如FOXL1、DKK3和WNT5B)。WNT2B+成纤维细胞的一个子集可能通过R-spondin-3的表达支持ISC生态位，它与ISC受体LGR5相互作用(de Lau et al.， 2011)。RSPO3+成纤维细胞表达其他WNT/BMP信号基因和几种不同的趋化因子，它们可能将免疫细胞招募到ISC生态位(Biton et al.，2018)。它们还可丰富结肠直肠癌(CRC)不良预后的基因预测(Calon et al.， 2015)，并可能通过促进干细胞样微环境支持肿瘤生长。
非炎症组织和炎症组织与健康组织共享谱系和细胞特异性表达变化。
尽管经内镜检查，非炎症组织和炎症组织具有相似的差异表达(DE)基因特征，表明UC的转录特征先于炎症或在消退后持续存在。通过上皮细胞，DE基因反映了通过激活先天免疫来恢复体内平衡的尝试，如抗菌和抗氧化防御途径，黏液蛋白生物合成，和主要组织相容性复合体(MHC) II类机制(Biton et al.， 2018;麦克唐纳和朱厄尔，1987年)。在基质中，成纤维细胞诱导了炎症、纤维化和组织修复的基因(Gieseck et al.， 2018)，而内皮细胞的变化支持了组织的血管化。在免疫细胞中，髓细胞和T细胞激活共刺激和共抑制基因，而B细胞上调IgG类转换和亲和力成熟的基因。
UC上皮细胞kynurenine通路的诱导。图中显示的是来自kynurenine通路的DE基因(行)(左)，这些基因分别来自发炎和健康的细胞亚群样本。斑点大小，表达细胞在健康(灰色轮廓)或炎症(黑色轮廓)样本中的比例;点颜色，表DE模型的显著系数(q < 0.05，基于模型的单细胞转录组学(MAST)hurdle模型分析，离散系数)
非炎症性与炎症性UC组织的比较(图S4A-S4F;表S4)显示了伴随炎症的上皮细胞的几种代谢变化。例如，嘌呤代谢的变化(如XDH和URAD)可能产生尿酸，与上皮损伤相关(Chiaro et al.， 2017)。上皮细胞也诱导kynurenine通路(图4A)，与疾病严重程度相关(Sofia et al.， 2018)。GPR35是一种kynurenic酸受体，被认为是一种危险基因(Huang et al.， 2017)。
UC肠上皮细胞的代谢重编程。图中显示的是混合线性模型(颜色条)所捕获的KEGG通路(行)在上皮亚组炎症和健康样本中的表达变化(图S5C中的所有亚组)。黑色轮廓，q < 0.05。
CD8+IL-17+ T细胞在UC中诱导IL17A/F、IL23R和细胞毒、共刺激和共抑制程序。图中分别为健康(左)、非炎症(中)、炎症(右)T细胞(x轴)中基因和程序表达的分布(y轴)(Wilcoxon test， *p = 0.05， p = 0.01， *p = 0.001);
T细胞的大多数亚群诱导共刺激和共抑制程序，与抑制免疫激活的尝试一致(Attanasio,Wherry, 2016)。CD8+IL-17+ T细胞和T (regs)从健康组织向非炎症组织向炎症组织扩展，并分别成为炎症过程中IL-17和TNF的主要来源。
免疫细胞在不同分组中的子群占比
Rewiring of Cell-Cell Interactions
健康组织、非炎症组织和炎症组织中的细胞-细胞相互作用网络。由细胞谱系(颜色)和平均比例(大小)标注。在疾病状态下，相对于空模型.
健康的相互作用描绘了明显的细胞间隔，而DE基因在疾病靶向的谱系间串扰和减少的细胞间隔，与UC相关的亚群作为关键的网络枢纽.
在健康的黏膜中，相互作用在很大程度上反映了肠道内稳态(如DC1细胞和T细胞;p < 0.05)。确切地说，上皮细胞与成纤维细胞和T细胞之间的非炎症相互作用丰富( p 小于的 负6次方 ), 而 发炎 组织 显示 明显的 B 细胞 和 T 细胞、 巨 噬 细胞 之间 和 CD8+IL-17+ 的 相互 作用 ( T 细胞所有 p 小于10 负4次).UC-相关子集(例如,M-like细胞,IAF,和炎症性单核细胞)是最核心网络中节点
表明他们调解不同细胞之间的信号的子集。细胞-细胞相互作用可以预测炎症过程中细胞亚群的浸润、增殖和分化。研究者假设细胞亚群比例的变化可以用其他细胞表达的细胞-细胞相互作用基因的变化来解释。对所有的细胞亚群对进行了测试，针对每个受体-配体对，研究了一个细胞亚群中配体的表达水平是否与表达其受体的细胞亚群的比例相关(包括自分泌相互作用)。分析发现了数以百计的显著的交互作用。
例如，炎症期间肠上皮细胞的IL18上调与Treg细胞比例增加有关，Treg细胞表达其受体IL18R1(r = 0.68)。在小鼠中，IL-18既能抑制Th17的分化，又能通过Treg细胞介导控制肠道炎症(Harrison et al.， 2015)。然而，上皮细胞在吸收Treg细胞进入结肠中的作用尚不清楚。表达IL22 ra1的肠上皮细胞的频率与调节肠道再生的IL22 CD4+活化Foshi T细胞的表达相关(Pelczar et al.， 2016;r = 0.55)。研究者在人结肠椭球体培养中验证了这种相互作用，IL-22孵育诱导了肠上皮细胞相对于ISCs显著富集的表达程序(图S6A;p 小于 10的负 10次方;Wilcoxon测试)。其它因子促进免疫细胞的招募(例如，B细胞的CXCL12)和基质细胞的扩张(例如，包膜细胞的PDGFD和IAFs的OSM)，或可能调节细胞存活、增殖或死亡的自分泌信号(例如，BEST4+肠上皮细胞的MST1和毛细血管后小静脉的TNFSF10)。
研究者开发了一个最小绝对收缩选择算子(LASSO)回归模型来识别跨越多个细胞类型的作用路线。例如，CD8+IL-17+ T细胞比例可以通过上皮细胞、T细胞、成纤维细胞和胶质细胞的自分泌和旁分泌相互作用的结合来解释
Differential expression of putative IBD risk genes in specific cell subsets
假定的IBD风险基因的细胞类型特异性表达。图中显示的是GWAS在各细胞亚群中牵连的IBD风险基因(柱状图)在在健康细胞中(中)，在UC细胞中(右)被鉴定为细胞或谱系特异性的的平均表达(行)，或只在健康以及只在UC 细胞中鉴定为细胞或谱系特异性的的平均表达(行)。星号表基因在健康和UC之间的特异性有显著变化。
一些细胞亚群被富集，表明和gwas暗示的的风险基因的表达相关(图7B)
Nominating IBD risk genes using gene modules
在许多情况下，多个假定的IBD风险基因是同一基因模块的成员，这使研究者能够定义10个“元模型”，跨越超过50%的gwas牵连的IBD风险基因，这可能反映了关键的疾病通路(经验的q < 0.05;图7 c;表S7;)。
通过利用单细胞共表达，研究者将超过50%的风险基因映射到10个元模块上(图7C)，并使用这些元模块指定跨位点的因果风险基因(图7E)。
DATA AND CODE AVAILABILITY
Raw data : the controlled-access data repository, Broad DUOS
Code used in this study : https://github.com/cssmillie/ulcerative_colitis
数据验证
验证在炎症中，存在T 细胞亚群表达的marker.
还使用了很多实验验证方法，在数据分析过程中来同步验证分析结果，详细见文献。
Immunofluorescence assay (IFA)
Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH)
Antibodies and RNA smFISH probes
总结
原创的分析方法很多，在文献中有详细的描述。
18例溃疡性结肠炎患者和12例健康人结肠粘膜细胞亚群各51个;
m样细胞、炎性单核细胞和成纤维细胞、CD8+IL-17+ T细胞在病变中扩增;
炎症性单核细胞和成纤维细胞中的Oncostatin M作用通路可能影响药物反应;
胞内基因的共同表达可推断出风险基因位点间的因果关系
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