在2010-2015年间，RNA-seq本身就是跟现在的单细胞差不多的当红炸子鸡的地位，无数的软件工具，网页数据库，测评文章涌现出来。很多课题组导师都认为做一个RNA-seq项目就能发CNS啦，就跟这两年大家以为做一个单细胞转录组项目就可以发CNS的坚信程度是一模一样的！

直到现在（2020），基于高通量测序技术的RNA-Seq方法仍然是转录组学研究中必不可少的工具。截止到（2016）已经普遍接受的是，标准化预处理步骤可以显着提高分析质量，特别是对于差异基因表达分析而言。然而，彼时尚未找到金标准归一化方法。我在生信技能树的教程呢，通常是直接就推荐3大R包（limma，edgeR，DEseq2），转录组的基本分析教程合辑：

• 上游分析视频以及代码资料在：https://share.weiyun.com/5QwKGxi

• 下游主要是基于counts矩阵的标准分析的代码 https://share.weiyun.com/50hfuLi

很多人就问我这样推荐的理由，有没有参考文献，但是前些日子一直比较忙，就没有回复大家。恰好最近整理我五年前收集的RNA-seq资料，重新发现了一个能比较好支持3大R包（limma，edgeR，DEseq2）的文献。

文章详情：Maza E (2016) In Papyro Comparison of TMM (edgeR), RLE (DESeq2), and MRN Normalization Methods for a Simple Two-Conditions-Without-Replicates RNA-Seq Experimental Design. Front Genet 7:164. [article]

一图概况如下：

文章提到了以下3个算法，做了一下测试数据的比较：

• The first method is the “Trimmed Mean of M-values” normalization (TMM) described in and implemented in the edgeR package.
• The second method is the “Relative Log Expression” normalization (RLE) implemented in the DESeq2 package.
• The third method is the “Median Ratio Normalization” (MRN).

作者的测试数据是：a matrix of counts: 34675 rows (genes) and 9 columns (samples from 3 stages and 3 biological replicates per stage). 一个  in silico calculations carried out on a given real data set from the tomato fruit set.

作者的结论很有意思：

• For a very simple experimental design, i.e., about two conditions and no replicates, users can use any of the three studied normalization methods with no impact on results.
• But, for a more complex experimental design, the MRN method could be adopted.

学徒作业，以仅提供bam文件的RNA-seq项目重新分析 教程提到的数据集为例子，比较3大R包（limma，edgeR，DEseq2）差异分析的结果，绘制一个韦恩图或者其它可视化的展现形式！因为这个RNA-seq项目的数据库链接在：https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB36947，仅仅是提供bam文件，如果你搞不定表达矩阵，可以发邮件找我索取，然后完成学徒作业！！！

历年学徒作业目录如下：

• 生信编程直播课程优秀学员作业展示1
• 生信编程直播课程优秀学员学习心得及作业展示3
• 生信编程直播课程优秀学员作业展示2
• 给学徒的GEO作业
• 这个WGCNA作业终于有学徒完成了！
• 上次说的gmt函数(学徒作业)
• 拖后腿学徒居然也完成作业，理解RNA-seq数据分析结果
• 肿瘤外显子视频课程小作业
• ChIPseq视频课程小作业
• Agilent芯片表达矩阵处理(学徒作业)
• 学徒作业：TCGA数据库单基因gsea之COAD-READ
• 学徒作业-在CCLE数据库里面根据指定基因在指定细胞系里面提取表达矩阵
• 学徒作业-指定基因在指定组织里面的表达量热图
• 学徒作业-我想看为什么这几个基因的表达量相关性非常高
• 学徒作业：给你8个甲基化探针， 你在tcga数据库进行任意探索
• 学徒作业-根据我的甲基化视频教程来完成2015-NPC-methy-GSE52068研究
• RNA芯片和测序技术的比较（学徒作业）
• 学徒作业-单基因的tcga数据挖掘分析
• ATCC终于出来了organoids资源
• 拿到7个DDR通路的基因集-学徒作业
• 绘图本身很简单但是获取数据很难
• 都说lncRNA只有部分具有polyA尾结构，请证明
• 学徒作业-hisat2+stringtie+ballgown流程
• 学徒任务-探索DNA甲基化的组织特异性
• 用WES和RNA-Seq数据提取到的somatic SNVs不一致
• 《GEO数据挖掘课程》配套练习题