月经周期过程人类子宫内膜的单细胞转录图谱
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文章信息
文章题目：Single-cell transcriptomic atlas of the human endometrium during the menstrual cycle
期刊：nature medicine
影响因子：36.13
作者：Stephen R. Quake
单位：斯坦福大学
DOI ：10.1038/s41591-020-1040-z
导读
在人类月经周期中子宫内膜经历了重塑、脱落和再生，所有的过程都是由潜在细胞层次中大量基因表达的改变驱动的。尽管在人类生育和再生中很重要，但对这一特异的组织内稳态类型的认识仍然不成熟。研究者在单细胞分辨率下对月经周期中人类子宫内膜的转录转化进行了描述，在多个维度阐释了细胞内的异质性。研究者对7个子宫内膜细胞类型在子宫内膜转变的四个主要时期的行为进行了绘制，包括之前没有描述的有纤毛的细胞类型，并且发现了每个细胞类型和时期的典型特征。研究者发现人类移植窗口的开放伴随上皮细胞一个突然的非连续的转录激活，以及基质成纤维细胞一个广泛的蜕膜化特征。研究者为月经周期过程人类子宫内膜转化提供了高分辨率的分子和细胞内特征描述，也为这一关键的生理过程提供了洞察力。
前言
人类的月经周期——子宫内膜每月的重塑、脱落和再生——与许多其他物种不共有。相似的周期仅在人类、猿、旧大陆猴、molossid蝙蝠以及多刺的老鼠中观察到，而不是在常应用的有性繁殖的模型生物例如老鼠、斑马鱼或者苍蝇中。一个循环可能通过排卵事件主要分为两个主要的时期：增殖性和分泌性。在分泌时期，子宫内膜进入一个结构和生化上有利于胚胎植入的接受状态的狭窄窗口，该时期是植入（WOI）的窗口或者分泌的中期。考虑到它与人类生育和再生生物学功能的相关性，在月经周期对子宫内膜转变进行系统描述是一直以来探究的目标。
子宫内膜不同于其他组织，包含多个类型的细胞，当进出细胞周期、重塑并且以相对更快的速率进行不同形式的分化时，通过每个月周期状态都有显著变化。组织学对月经的、增殖性、早期-、中期-和晚期分泌性时期进行了形态学的定义。整个组织转录学图谱将定义提升到了一个分子定量的水平，并且转化至临床用于确定体外受精和胚胎转移中WOI的时间。在这里，研究者致力于在最小的误差范围对子宫内膜细胞类型和状态进行分离和鉴定，并且利用高分辨率的单细胞RNA-seq技术。通过对组织静态和动态的研究，研究者发现标志事件的分子特征，例如WOI，并且对人类月经周期子宫内膜细胞在细胞类型、状态、增殖和分化水平转化提供了一个系统单细胞转录组的描述。
结果
为了描述在自然的人类月经周期中子宫内膜细胞的转化，研究者在19名健康的卵子捐献者月经出血开始后4-27天后收集了子宫内膜活检。所有的妇女都有规律的月经周期，不受外源激素或者妇科病理的影响。利用Fluidigm C1介质芯片捕获单细胞并且生成互补的DNA。为了验证C1数据集中的结果，研究者利用10x Chromium收集了额外10个健康卵子捐赠者的数据。
通过t-SNE对过度分散的基因进行降维分析发现，细胞被明确的分离为不同的群体（图1a）。研究者将细胞类型定义为没有时间关联的群体，也就是说群体包括在月经周期采样的细胞。研究者共鉴定了6个细胞类型，经典的标记物以及高度差异表达的基因能够直观的鉴定出其中四个：基质成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞以及淋巴细胞（图1b）。剩余两个细胞类型都表达上皮相关的标记物，其中一个有大量特异表达的基因。功能分析发现56%的基因被注释为纤毛相关细胞组分或者生物学过程（图1c），由此将这一细胞类型定位为“纤毛上皮”，特别是运动纤毛。研究者将另一纤毛细胞类型定义为“无纤毛上皮”。最后研究者利用10x数据集检测了在更大样本中是否能够捕获其他的细胞类型，结果发现平滑肌细胞只在10x中捕获而在C1数据集中没有（图1d）。考虑到这一细胞类型与巨噬细胞具有相当的丰度，可能是由于形状和大小逃脱了C1捕获位点。PDGFRB、MCAM以及SUSD2的表达提示这一平滑肌细胞类型包括之前鉴定出的具有间质干细胞特性的子宫内膜细胞。
利用RNA和蛋白复合染色，研究者将之前未注释的标记物和上皮谱系鉴定为子宫内膜纤毛细胞并且空间可视化这些细胞的原位分布。将细胞类型中高度区别的四个基因进行了RNA染色（图1b），但是没有明显的功能注释(C11orf88、C20orf85、FAM183A)或者被注释为非纤毛相关的功能(CDHR3)。研究者在月经周期7天（图2a、b）和25天（图2c、d）的腺体（图2a、c）或者管腔（图2b、d）中发现这四个基因与FOXJ1蛋白（上皮谱系运动纤毛的主要调节因子）共表达。这一结果证实健康人类月经周期中，这些纤毛细胞作为上皮细胞嵌入的子宫内膜的管腔和腺体上皮，同时也说明在周期中研究者鉴定的新标记物具有一致的区分。
月经周期人类子宫内膜转化包含四个主要的时期
样本采集于月经周期并且依据月经周期的天数进行标注。时间变量作为评价子宫内膜细胞状态的信息指标，在女性间月经周期长度的变化极易产生偏差，并且个体间细胞的变化使得分辨率受限。为了以无差别的方式对子宫内膜转化的转录组学进行研究，研究者分别利用无纤毛上皮和基质成纤维细胞的全转录组数据进行了细胞类型的t-SNE分析。这两种细胞类型在子宫内膜转化中发挥重要作用。结果显示这两种细胞类型都有四个主要的时期，研究者称之为时期1-4。虽然这四个时期与时间显著相关，两个妇女她们的时期分配和月经周期的天数之间顺序是相反的。此外周期同一天的妇女被划分为不同的时期，说明如果直接利用月经的天数进行定量，月经周期长度、偏差以及分辨率都会存在变化。
在无纤毛上皮上WOI开放伴随突然、非连续的转录激活
研究者利用基于MI的方法构建了模型，不仅保持了相位特征，而且允许对每个细胞沿着月经周期的时间轨迹进行伪时序分析（图3a）。研究者观察到同一妇女时间和伪时序之间（图3b）、无纤毛上皮和基底成纤维细胞的伪时序（图3c）之间高度相关，证实了轨迹的有效性。重要的是，研究者在无纤毛上皮的时间轨迹中观察到时期4和之前的时期之间显著的不连续（图3a）。这种不连续性在降维或者特征富集方法中同样观察到。考虑到所涉及的活组织检查最大间隔1天，在基质成纤维细胞中并未观察到相似的不连续性，这不可能是人为造成的样本密度。
为了理解这种不连续性的本质，研究者利用MI计算鉴定了子宫内膜转化中沿单细胞轨迹显著变化的基因。基于全局最大的伪时序对这些基因进行排序，结果发现月经周期中转录组学变化的整体特征。在无纤毛上皮，动态性说明时期1-3整体的连续特征，直到标记进入时期4的基因突然且一致激活。这一模块的基因包括PAEP、GPX3以及CXCL14（图4a），与之前报道的全组织转录组数据是一致的，尽管在全组织图谱中显著差异，在WOI中过表达。因此，进入时期4可被鉴定为WOI或者分泌中期的开放。
WOI在基质成纤维细胞中具有广泛的蜕膜化特征
与上皮细胞不同，基质成纤维细胞转录组的动态变化说明连续阶段的基因以模块的形式上调（图4b）。在时期4基质成纤维细胞中上调的基因包括DKK1和CRYAB，在全组织分析中也有一些其他的通过常识概括，进一步证实了WOI的状态，尽管转变并不像上皮细胞那样突然。在同一模块中研究者观察到了蜕膜化起始的转录因子FOXO1以及蜕膜化基质标记物IL15。重要的是，尽管它们在时期4的上调显著，在时期3较低比例的细胞和较低的表达水平中已经很显著了。
蜕膜化是基质成纤维细胞从延长的成纤维样细胞向更大的圆形细胞转化（图4c），具有特定的细胞骨架修饰，在胚胎侵袭和妊娠中起重要作用。研究者的数据提示这一过程在一小部分基质成纤维细胞WOI开放之前起始，并且在接受状态下组织蜕膜化的特征广泛存在于基质成纤维细胞中，与组织学观察到的结果一致。因此研究者的分析表明无纤毛上皮中子宫内膜可接受状态转变的发生，伴随着突然的转录活化以达到WOI相关基因一致高度上调的状态，与基质成纤维细胞中逐步转变相反。
在C1和10x数据集中利用降维以及两个锚定活检，研究者同样将10x数据集中的活组织检查分配到各自的时期。为了进一步提高描述WOI开放的分辨率，研究者探究了月经周期19天和23天之间，WOI可能开放时6/10活组织检测的10x数据集。将两次锚定活检作为参考点，7/10活检被排列为早期-和中期分泌时期。在这些活检中对WOI相关基因的检测证实相较于基质成纤维细胞，无纤毛上皮有更多的WOI基因突然活化。此外，随着两个上皮亚型间时间和分层的分辨率升高，研究者观察到在分化的时间和空间图谱上无纤毛上皮中WOI基因更细微的动态变化。例如，MAOA和NUPR1的活化早于DPP4，尽管在无纤毛上皮的两个亚型中水平相当。在管腔上皮中CXCL14、GPX3以及PAEP的活化晚于腺体中的细胞。尽管如此，直到所有WOI基因在两种亚型中高度一致上调，时间进展达到锚定活检定义的WOI状态，与C1数据集中观察到的结果一致。
WOI关闭伴随持续的转录转变
无纤毛上皮中WOI开放伴随突然的转录活化，而以渐进的转变方式关闭（图4a）。在时期4无纤毛上皮中表达的基因主要在三个群体，并且具有不同的动态特征。群体1基因（例如PAEP, GPX3）在时期4中持续表达，并且在新循环的时期1仍然显著。对于晚期时期4，群体2基因（例如CXCL14, MAOA, DPP4以及金属硫因）显著降低，而群体3基因（例如THBS1, MMP7）上调并且持续到新循环的时期1。因此群体2和3的基因有助于确定从中期-到晚期-分泌时期的转变，并且由此关闭WOI，而所有三个基因群体——它们的表达和缺失——可应用于从其他子宫内膜时期区分WOI。同样，基质成纤维细胞中的平行转变也具有三个特征性的基因群体和持续的动态变化（图4b），代表人类月经周期蜕膜化的进程，不同于怀孕时期，最终导致子宫内膜脱落。
WOI相关转录调节因子在WOI开放和关闭时典型的调节作用
在无纤毛上皮整体的转录调节因子（TF）动态变化说明一个单一的主要不连续性，而在基质成纤维细胞中未观察到类似的不连续性。研究者发现在WOI（群体1）到达峰值的TFs具有显著不同的功能相较于那些在周期末（群体2）到达峰值的那些转录因子。在无纤毛的上皮中，群体1的TFs主要是早期发育调节因子，特别是在分化过程中的IRX3、PAX8、MITF、ZBTB20，而在群体2中包括DDIT3和FOS、FOSB、JUN。在基质成纤维细胞中，群体1包含cAMP信号通路调节的软骨细胞分化调节因子BHLHE40、ATF3——可能是蜕膜化的驱动因子——然而群体2包括内质网应激（YBX3, ZBTB16）、炎症(CEBPD)以及凋亡(STAT3)相关的基因。重要的是，在无纤毛上皮中金属硫蛋白I启动子的激活因子MTF1与金属硫蛋白I基因同时上调(MT1F, 1X, 1E, 1G; 图4a)，提示这些重金属绑定的蛋白可能是与WOI相关的重要调节模块。
类固醇激素的核受体是一类特异调节子宫内膜和其他女性生殖器官交流的TFs群体。在两种细胞类型中增殖其到分泌期ESR1和PGR的mRNA水平与之前蛋白组学和组织学的结果是一致的，尽管在组织学水平量化的基质成纤维细胞中PGR降低比较中等，并且落后于mRNA水平。
研究者对编码分泌蛋白的基因进行了类似的分析。IGFBP1和PRL是孕早期鉴定子宫内膜蜕膜化的两个分泌蛋白。通过原位mRNA染色研究者观察到未妊娠时在子宫内膜上皮和基质成纤维细胞的分泌中期IGFBP1局部表达。研究者观察到在无纤毛上皮中IGFBP1表达的细胞丰度高于基质细胞，C1数据和10x数据集都有验证，然而PRL在整个周期中的表达水平很低。
两项对怀孕早期人类子宫内膜的单细胞研究发现基质成纤维细胞的三个亚型，包括共表达IGFBP1和PRL的不同亚群。然而研究者在基质成纤维细胞中并未观察到显著的亚群分离（图3），观察到在分泌中期到晚期共表达IGFBP1和PRL的细胞数量有限，提示相较于孕早期子宫内膜基质成纤维细胞，细胞层次的异质性较小。对采样高出一个数量级的10x数据进行检测研究者发现它们相对的同质性不是由于采样不足造成的，而是由于缺乏PRL的表达。更具体的是，尽管IGFBP1表达的基质成纤维细胞从分泌中期到晚期显著升高，PRL表达的细胞仍然很少，表达这两种基因的细胞也同样。此外，上述提及的孕早期研究，进一步将不协同上调IGFBP1和PRL的基质成纤维细胞分为两个亚群。定义这两个亚群的基因表达谱——例如ACTA2和IGFBP1发现，在未怀孕和正常循环的子宫内膜中基质成纤维细胞蜕膜化，尽管异质性更少，却在孕早期表现出分化的潜能。
单细胞转录组水平鉴定的子宫内膜分期与经典的之间的关系
自20世纪50年代正式形成以来，对子宫内膜时期的组织学定义，即增生性，早期，中期和晚期分泌阶段——已被用作确定子宫内膜状态的黄金标准。因此研究者探究了组织学时期与单细胞水平鉴定时期之间的关系。细胞有丝分裂是增生性子宫内膜最显著的特征之一。因此为了鉴定增生性与分泌性时期的边界，研究者探究了整个月经周期细胞周期的活性。在无纤毛的上皮和基质成纤维细胞中，细胞周期在时期1和2升高，在晚期停止，提示从增生性到分泌性时期的转变发生在时期2和时期3。典型特征富集的生物学过程以及时期1-4与整个组织水平的关联进一步证实这一点。随着边界的确定，以及WOI提供的锚定，时期3与分泌早期相关，并且时期1和2分别被鉴定为增生性早期和晚期。组织学结果显示增生性子宫内膜的转化其形态学变化是逐步发生的，并未识别不同的亚时期。然而研究者发现在转录水平，无纤毛上皮和基质成纤维细胞中增殖性子宫内膜可能被分为两个不同的时期，能够通过转录组学的特征进行定量。研究者并未鉴定出一个不同的增殖性中期。
分离腺体和管腔上皮中转录组学特征
在无纤毛上皮，研究者注意到C1和10x 数据集中，垂直于整体的月经周期细胞进一步分离。在多个时期持续分化亚群的基因中（图5b-d），研究者发现与管腔和腺体上皮相关的基因。例如WNT7A在所有增生性时期的亚群中过表达（图5c），并且在人类、灵长目、小鼠子宫内膜管腔上皮中特异表达。同样，研究者在多个时期的两个亚群中发现LGR5、ITGA1以及FOXA2的差异表达（图5c、d），之前原位研究也证实在人类和小鼠中管腔和腺体上皮之间差异表达。同样的表达图谱在10x数据集中得以重现。因此，这些偏离的亚群被鉴定为腺体和管腔上皮。差异表达的基因也包括那些与子宫内膜重排以及胚胎着床相关的基因，例如LIF、MMP26以及MT1E（图5c）。
在增生性时期的管腔上皮中过表达的基因进行功能富集分析（图5e），结果发现在与组织结构发育相关的形态发生和管腺增生中大量富集，并且在导致分化的形态发生中富集。在人类胎儿子宫发育过程中腺体形成相关的Wnt信号通路也在这一基因群中富集。另一方面，在增生性时期腺体上皮最显著的功能特征与更高比例的循环中细胞一致。
人类自然月经周期的蜕膜化表现为淋巴细胞和基质成纤维细胞之间的直接作用
浸润型淋巴细胞在孕期、蜕膜化的血管再生以及滋养层侵袭调节中发挥重要作用。然而在人类自然月经周期中蜕膜化的功能仍有待定义。鉴于在早期分泌阶段淋巴细胞丰度显著升高，研究者对它们的转录组学变化进行了描述，以探究在蜕膜化过程中它们的作用以及与其他子宫内膜细胞类型之间的相互作用。与未蜕膜化的子宫内膜相比，蜕膜化子宫内膜（时期4）中的淋巴细胞能够更高的表达孕期子宫NK细胞的标记物(CD69, ITGA1, CD56)，并且表达更多样的活化的以及抑制的NKR识别MHC（图6a）。研究者观察到表达NK和T细胞标记物的淋巴细胞与只表达NK标记物的细胞，基于T细胞特征标志物的表达将它们划分为CD3+和CD3-的细胞（图6b）。
接下来研究者对整个月经周期淋巴细胞中显著变化的基因进行了鉴定，并将与免疫功能相关的进行了描述（图6b）。在CD3-细胞中研究者观察到蜕膜化子宫内膜中细胞毒颗粒基因明显增多，GNLY除外。在CD3+细胞中，细胞毒性升高表现为CD8的升高，而细胞毒性颗粒基因的升高仅为中度。在这两个细胞亚群中，在蜕膜化子宫内膜中编码IL2受体的基因表达升高显著。同样显著的是参与IL2引发的细胞激活的基因。关于细胞因子/趋化因子库，在蜕膜化子宫内膜CD3-细胞高表达趋化因子。而CD3+虽然表达更多样的细胞因子，但是趋化因子的表达更低。最终，研究者在蜕膜化子宫内膜中研究者观察到配体-受体对在各自基质成纤维细胞和淋巴细胞中高表达，例如IL15、IL2RB、IL2RG、MHC家族基因以及NKR（图6a-c），提示两种细胞类型存在直接相互作用。利用免疫荧光技术，研究者比较了鉴定的免疫亚群和蜕膜化前（图6d、e）以及过程中（图6f、g）的基质成纤维细胞之间的空间接近性，并且观察到在蜕膜化过程中接近基质成纤维细胞表达CD3（图6d、f）或者CD56（图6e、g）蛋白的免疫细胞亚群数量显著升高，提示两个细胞之间存在直接相互作用。
结论
研究者致力于在最小的误差范围对子宫内膜细胞类型和状态进行分离和鉴定，并且利用高分辨率的单细胞RNA-seq技术。通过对组织静态和动态的研究，研究者发现标志事件的分子特征，例如WOI，并且对人类月经周期子宫内膜细胞在细胞类型、状态、增殖和分化水平转化提供了一个系统单细胞转录组的描述。
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