单细胞分析十八般武艺4：velocyto

单细胞测序技术的发展日新月异，新的分析工具也层出不穷。每个工具都有它的优势与不足，在没有权威工具和流程的单细胞生信江湖里，多掌握几种分析方法和工具，探索数据时常常会有意想不到的惊喜。

往期专题

速率分析的原理

大家第一次听到RNA速率/速度，是不是感觉和我一样懵呢？再看文献提到的时间导数、微分方程和一大堆公式，是不是更搞不清作者在讲什么？我们常用的基因表达矩阵，如velocyto的作者在文献中所讲，反映的是细胞转录组的瞬间快照。其实在生命体中，每时每刻都发生着mRNA的转录、剪接和降解，它们当然都是有速度的，作者在文中用α、β和γ表示这些速度。不仅mRNA的转录、剪接和降解有速度，前体mRNA和成熟mRNA的丰度变化也有速度，作者所讲的RNA速度特指成熟mRNA的丰度变化速度。RNA速度可以通过前体mRNA和成熟mRNA的指标来估计，并且可以用来预测细胞未来数小时内的状态。在velocyto的动力学模型中，作者假定转录速度 α恒定，此时unspliced mRNA（u）和未来的spliced mRNA（s）的丰度高度相关：

系数 λ 综合了降解率和剪接率、基因调控特性、内含子和外显子长度的比值以及内部启动位点的数量等因素。绝大多数的基因在不同细胞类型中，系数 λ 固定不变，但是11%的基因在不同组织中 λ 值不同。为了证明此模型的正确性，作者使用小鼠肝脏的节律基因来验证：

总的来说：unspliced mRNA丰度与spliced mRNA丰度高度相关且具有先导性，因此可以据此推断细胞的分化方向与速率。

velocyto分析流程

1. 使用python版velocyto将bam文件转换为包含spliced，unspliced和ambiguous三个矩阵的loom文件；
2. 读取 loom文件并转换为surat对象；
3. 对seurat对象执行数据标准化及降维聚类操作；
4. 计算RNA速率；
5. 展示细胞分化的方向。

velocyto分析示例

本文演示数据来自velocyto官方教程：http://pklab.med.harvard.edu/velocyto/notebooks/R/SCG71.nb.html

library(Seurat)
library(velocyto.R)
library(tidyverse)
library(SeuratWrappers)
##数据基础分析
# 读取loom文件
velo <- read.loom.matrices(url("http://pklab.med.harvard.edu/velocyto/mouseBM/SCG71.loom"))
# 转换为seurat对象
velo <- as.Seurat(x = velo)
# 降维聚类
velo <- velo %>% SCTransform(assay="spliced") %>% RunPCA(verbose=F) 
ElbowPlot(velo, ndims = 50)
nPC=1:20
velo <- FindNeighbors(velo, dims = nPC) %>% FindClusters() %>% 
        RunUMAP(dims = nPC) %>% RunTSNE(dims = nPC)

##给细胞分配颜色
ident.colors <- (scales::hue_pal())(n = length(x = levels(x = velo)))
names(x = ident.colors) <- levels(x = velo)
cell.colors <- ident.colors[Idents(object = velo)]
names(x = cell.colors) <- colnames(x = velo)

##速率分析
velo <- RunVelocity(velo, deltaT = 1, kCells = 25, fit.quantile = 0.02, 
        spliced.average = 0.2, unspliced.average = 0.05, ncores = 18)
#kCells：用于斜率平滑度计算最近邻细胞数量，越大越平滑，越小越能反映局部特征
#fit.quantile：0.02代表对基因表达量最高2%与最低2%的值执行gamma拟合
#spliced.average：过滤低表达丰度基因的标准，计算的是基因在cluster内的平均counts值
#unspliced.average：同上

##全局速率可视化
emb = Embeddings(velo, reduction = "umap")
vel = Tool(velo, slot = "RunVelocity")
show.velocity.on.embedding.cor(emb = emb, vel = vel, n = 200, scale = "sqrt", 
       cell.colors = ac(cell.colors, alpha = 0.5), cex = 0.8, arrow.scale = 3, 
       show.grid.flow = TRUE, min.grid.cell.mass = 0.5, grid.n = 40, 
       arrow.lwd = 1, do.par = FALSE, cell.border.alpha = 0.1)

##特定基因速率可视化
gene = "Camp"
RunVelocity(velo, deltaT=1, kCells=25, fit.quantile=0.02, old.fit=vel, 
       cell.emb=emb, cell.colors=cell.colors, show.gene=gene, do.par=T)

velocyto分析难点

• bam转loom：bam文件转loom矩阵文件需要使用python版的velocyto，安装使用都比较困难，经常会有意想不到的报错。我可以提供有偿服务，帮大家完成bam文件的转换处理。
• velocyto.R安装：R语言版的velocyto.R安装比较复杂，需要安装几个Linux库文件，初学者很难自己完成，建议使用我的docker镜像搭建分析环境。教程参考《华为云配置单细胞分析环境及报错处理》，最新的镜像下载地址在《kinesin_rstudio的日常升级二》中有链接。
• Seurat与velocyto整合：很多人希望从seurat的结果中抽取一个亚群来做速率分析，但是velocyto从bam文件得到表达矩阵是所有细胞的，降维聚类的结果与seurat也有差异，因此初学者很难将两者整合在一起。

交流探讨：如果您阅读此文有所疑惑，或有不同见解，亦或其他问题，可以点击阅读原文联系探讨。

往期回顾

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