成年小鼠肾脏snRNA-seq和scRNA-seq之比较
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文章信息
文章题目：Advantages of Single-Nucleus over Single-Cell RNA Sequencing of Adult Kidney: Rare Cell Types and Novel Cell States Revealed in Fibrosis
期刊：JASN(Journals of the American Society of Nephrology)
日期：2019.01.30
DOI：https://doi.org/10.1681/ASN.2018090912
IF：8.5470
摘要
背景：肾脏和其他固体组织的单细胞基因组研究面临的一个挑战是获得高质量的单细胞悬液，该悬液含有稀有或难以分离的细胞类型，并且既没有RNA降解，也没有人为的转录应激反应。
方法：比较DropSeq平台单细胞RNA测序(scRNA-seq)和sNuc-DropSeq，DroNcseq,，10X Chromium(snRNA-seq)在成年小鼠肾脏的应用，并对单侧输尿管梗阻(UUO)术后14天小鼠肾脏纤维化进行验证。
结果：在比较阶段共产生11391个转录本。作者在scRNA-seq数据集中确定了10个亚群，但没有肾小球细胞类型，其中一个亚群主要由人工解离诱导的应激反应基因组成。相比之下，来自所有三个平台的snRNA-seq捕获了scRNA-seq数据集中没有的多种肾脏细胞类型，包括肾小球足细胞、系膜细胞和内皮细胞，且未检测到应激反应基因。与已发表的scRNA-seq数据集相比，作者的snRNA-seq方案产生的足细胞数增加了20倍(分别为2.4%和0.12%)。出乎意料的是，单细胞和单核平台具有同等的基因检测灵敏度。为了验证，对冷冻第14天的UUO肾脏的分析显示罕见的肾小球旁细胞，新的激活的近端小管和成纤维细胞状态，以及以前未知的肾小管间质信号通路。
结论 ：在小鼠（C57BL/6）成年肾脏中，snRNA-seq可实现与scRNA-seq相当的基因检测，并且具有明显的优势，包括减少解离偏倚，与冰冻样品相容，消除解离诱导的转录应激反应，并成功地应用于炎症纤维化肾脏。
介绍
目前单细胞RNA测序(ScRNAseq)对肾脏的研究进展飞速，但仍有三个限制：
首先，目前的方案不能准确地捕获所有类型的肾脏细胞，因为分离本身可能会损害敏感细胞，同时无法释放其他被胶原基质包围的细胞。 第二，目前用于单细胞解离的酶和机械方法引入了应激诱导的转录伪影。 最后，目前的方法与冷冻材料不兼容，当组织可获得性不可预测或诊断需要时间时，这会使分析变得复杂--例如肾活检。
因此，单核测序开始登上舞台。
方法
单细胞分离甲醇固定 单核分离 Single-Cell DropSeq、SNUC-DropSeq、DroNc-Seq和SNUC-10x，建立文库 单侧输尿管梗阻手术（以上内容感兴趣可以前往原文中） 生物信息学分析（简单介绍下游过滤标准） 对于所有平台生成的数据集，使用Seurat进行质量控制、降维和细胞聚类。每个平台的原始UMI计数矩阵分别加载到Seurat中。为了标准化，UMI计数矩阵按总UMI计数缩放，再乘以10,000，然后转换成log。只保留了在>3细胞中表达的基因。UMI定位于线粒体基因的比例相对较高(>=0.5)的细胞被丢弃。只保留检测到300多个基因的细胞，以去除低质量的细胞或细胞核。
结果与讨论
作者从8周龄小鼠肾脏中分离出单个细胞，用流式细胞仪纯化，进行单细胞以及单核RNA测序(SnRNAseq)。总共产生了11391个转录组本。
只要内含子序列被定位，单核RNA测序的性能就等同于或优于单细胞RNA测序。
图1A显示，对于单细胞DropSeq(ScDropSeq)，大多数映射序列是外显子，而对于单核DropSeq(SnDropSeq)、DroNc-seq和sn10x，大多数序列是内含子。映射序列的平均数量在不同平台上是相似的，但只有在同时包括外显子和内含子序列的情况下才会如此(图1B)。只要作者同时使用映射的外显子和内含子序列，在所有四个平台上检测到的每个细胞的平均基因数量也是相似的，尽管细胞核包含的mRNA比整个细胞少得多(图1B)。由于线粒体是胞质的，作者只使用scDropSeq检测到线粒体转录本，它们占所有scDropSeq基因的24%(图1B)。在减去线粒体基因后，所有三种单核技术实际上都比scDropSeq实现了更好的每细胞基因检测。
(A)根据平台定位到外显子、内含子和基因间隔区的序列。 (B)每个细胞的平均读数(NREAD)，每个细胞的平均独特基因数(Ngene)，以及跨平台的每个细胞的线粒体读数的平均百分比，根据只使用外显子读出或外显子和内含子读出的情况。
外显子和内含子序列的映射对于提高snRNA-seq数据集的质量的重要性从所有三个平台上非零序列百分比的改善中可见一斑(图1C)。在较低的映射序列深度下，scDropSeq和DroNc-seq在每个细胞中检测到的独特基因比snDropSeq或sn10x多10%-25%；但是，在较高的序列深度时，差异缩小(图1D)。
(C)在单独外显子序列或外显子和内含子序列的基础上，所有技术中每个细胞非零序列的百分比。 (D)使用不同平台将读数映射到基因图谱30。单元格DropSeq(ScDropSeq)和DroNc-seq在低(每个细胞10,000个映射序列)到中范围(每个细胞20,000个映射序列)测序深度方面显示出优势。
仅使用外显子序列，作者只能从DroNc-seq数据集中识别出四个亚群，而scDropSeq数据集产生了七个亚群(图1、E和F)。
(E)仅基于作图外显子序列的来自DroNc-seq数据集的1469个上皮细胞的t分布随机邻居嵌入(TSNE)图。 (F)来自scDropSeq数据集的1469个匹配上皮细胞的tSNE(也仅基于外显子读数)。
内含子的加入将DroNc-seq亚群改进为6种细胞类型，但没有改变scDropSeq的亚群数(图1，G和H)。虽然scDropSeq比DroNc-seq多产生一个亚群，但这是一个表达解离过程中诱导的应激反应基因的人工产物亚群。
(G)使用外显子和内含子序列改进了来自DroNc-seq数据集的1469个上皮细胞的聚类。 (H)使用外显子和内含子序列，来自scDropSeq数据集的1469个匹配的上皮细胞的群集几乎没有变化。
包括内含子序列改善了DroNc-seq的亚群凝聚力(亚群内平均共聚集性)和分离性(与最近亚群的平均共聚集性差异)，但不包括scDropSeq(图1，I和J)。
(I)单细胞核测序和(J)细胞绘制的群集凝聚力(平均群集内共同群集)和分离(群集内共同群集和最大群集间共同群集之间的差异)。基因表达的量化，包括内含子，增加了细胞核的凝聚力和分离度，但不是细胞亚群。CD-PC，集合管主细胞；DCT，远曲小管；LH，Henle环；PT，近端小管。
单核RNA测序减少技术解离偏倚
组织分离过程中释放的Ambient mRNA可能会污染scRNA-seq数据。在作者的数据中，发现了类似的跨平台小管污染，与scRNA-seq相比，snRNA-seq的污染程度略有降低
作者使用整合分析来鉴定使用不同平台(scRNA-seq和snRNA-seq技术)产生的细胞类型，并通过对齐的典型相关分析进行批量校正。作者鉴定了13个亚群在合并的数据集中，包括足细胞、内皮细胞和系膜，9个小管亚群和1个巨噬细胞亚群(图2，A和B)。
这个数据集与其他三个最近的肾脏RNA测序数据集的比较证实了作者的亚群注释(补充图3)。将每个细胞的来源投影到tSNE上，揭示了每个平台对每个亚群的相对贡献(图2C)。
所有三种单核方法在检测足细胞、内皮细胞和间质细胞方面都有更高的灵敏度(图2D)。事实上，当scDropSeq数据被单独聚集时，根本没有独立的足细胞或内皮细胞亚群，而所有三个单核平台都识别了这些细胞类型。作者结合了从scDropSeq以及Park等人2获得的足细胞频率，并将它们与在作者的snRNA-seq数据集中观察到的频率进行了比较。这表明，与scRNA-seq相比，snRNA-seq的足细胞数量增加了20倍(2.4%比0.12%；P=0.02)(图2e)。
单核RNA-seq检测到与单细胞RNA-seq相似的基因，且没有人为的转录应激反应。
作者发现大多数表达的基因(9588；71.4%)在细胞核和细胞中表现出相似的检测(20%的差异)，而只有452个基因(3.4%)在至少25%的细胞中被检测到，在细胞核中检测到266个基因(2.0%)，比在细胞中检测到的基因至少多25%(图3A)。同样，只有5.0%(676个基因)的检测基因在细胞中的表达高于细胞核(倍数变化.1.5；调整后的P值，0.05)，863个基因(6.4%)在细胞核中的表达高于细胞(图3B)。
ScDropSeq数据集中丰富的基因包括线粒体和核糖体基因以及热休克途径中的基因(图3C)。
(E) The 650 glomerular cells from DroNc-seq and single-nucleus DropSeq (snDropSeq) plus the 650 matched cells from a glomerular cell atlas3 coprojected by the t-distributed stochastic neighbor embedding(tSNE) reveal podocyte (Pod),mesangial cell (MC), and endothelial cell (EC) clusters.
富核基因包括许多驱动细胞特性的基因，如溶质载体和转录因子，这与大脑最近的一份报告一致。作者还可以在单核测序中优先检测到长的非编码RNA，而不是单细胞(图3D)。
作者使用DropSeq生成的最近出版的小鼠肾小球单细胞图谱（这里的图谱应该是测了许多单细胞，从而能够发现这些稀有细胞，显然这是昂贵的。作者这里单细胞测序发现的稀有细胞是很少的），询问这些差异是否会改变细胞分类。作者从snDropSeq和DroNc-seq中提取了足细胞、内皮细胞和系膜细胞(总共650个细胞)，单细胞图谱和细胞核数据集对每个数据的贡献相等（也就是说单核测序很好的重复了细胞图谱的分类）(图3F)。
(F) Equal representation of cell and nucleus RNA sequencing data in all clusters.
使用MetaNeighbor，作者验证了scDropSeq确定的每种肾小球细胞类型在由snDropSeq确定的相应细胞类型的AUC特征曲线得分下具有非常高的区域，而对于其他两种细胞类型(图3G)具有非常低的面积。
这表明作者的snRNA-seq数据集以高度的置信度重复了细胞分类，尽管细胞核中某些基因的丰度与整个细胞有所不同。
在作者的scDropSeq数据集中，应激反应基因是在蛋白水解组织在37°℃时被诱导的，在应激反应基因的基础上形成了一个全新的亚群(图3、H和I)。核解离是在冰上进行的，阻止了新的基因转录。
作者可以在小鼠肾小球图谱的所有细胞中检测到丰富的应激反应基因表达，这在snDropSeq生成的数据中是缺失的(图3J)。
比较不同类型肾小球细胞的差异基因表达显示，在scDropSeq数据中检测到线粒体基因、热休克基因和与凋亡相关的基因，而在snDropSeq数据中没有检测到这些基因(图3K)。
作者在纤维化和炎症的UUO第14天肾脏上验证了作者的snRNA-seq方案；在sn10x平台上生成了6147个单核转录本，平均每个核有763个独特基因和1206个唯一分子识别符。非监督分析通过tSNE确定了17个独特的细胞团(图4A)。
其中包括两个新的近端小管群体，其中一个具有强烈的增殖基因特征(图4B)；
因此，作者将这一亚群注释为增殖的近端小管细胞。它还表达损伤标志物，包括Havcr1和Vcam1(图4C)。
另一个新的近端小管亚群不处于周期中，但表达了强烈的细胞动态转录特征。作者将其注释为去分化的近端小管亚群。Dock 10在去分化亚群中富集(图4D)，该基因通过Cdc42途径调节细胞的形态发生。
作者可以根据肾素1和内皮素A受体的表达来检测罕见的肾小球旁器细胞(图4E)。
最后，作者以细胞特异性的方式分析了受体-配体对，以说明snRNA-seq是如何揭示细胞间意想不到的交流途径的。作者发现了已知的(Bmp6、Pdgfd和Spp1)和新的(Sema3c、Sema6a、GPC和Slit3)信号关系(图4F)。图4G总结了这些纤维化的肾小管间质串扰通路。
总结
在成年小鼠肾脏研究中：
只要内含子序列被定位，单核RNA测序的性能就等同于或优于单细胞RNA测序。 单核RNA测序减少技术解离偏倚。 单核RNA-seq检测到与单细胞RNA-seq相似的基因，且没有人为的转录应激反应。
OSCA单细胞数据分析笔记12—Intergrating Datasets
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