浅谈单细胞转录组测序中的捕获效率提升
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高通量单细胞测序的本质是细胞与barcode的独立配对，但往往很难达到在满足通量要求下的完美效率。促使笔者写这篇文章的原因，是最近发表在Nature method上的一篇文章Ultra-high-throughput single-cell RNA sequencing and perturbation screening with combinatorial fluidic indexing，这篇文章介绍的是对10X单细胞转录组测序捕获效率的一些优化。10X自2016年以来，已有5个年头，虽然单细胞相关的公司正在不断涌现，但依旧无法撼动其地位。而10X的单细胞原理，是基于油包水的磁珠细胞配对的模式，很容易想象，如果未经优化的简单的进行两个流路的交叉融合，很容易出现多个磁珠多个细胞的排列组合方式，这在后续的单细胞分析中是灾难的。所以，往往最简单的优化就是对溶液进行大量的稀释。
此外，磁珠也有文章可做，10X 和 inDrop 系统中使用的珠子由水凝胶制成，而 Drop-seq 使用脆性树脂。通常，珠子和细胞以低浓度引入，以减少形成双峰的机会；也就是说，两个细胞或两个珠子被封装在一个液滴中。因此，对于使用小硬珠的 Drop-seq，同一液滴中的一个珠和一个细胞的封装遵循双泊松分布，当然，如果是微孔的方法，同样遵循双泊松分布，那这样的效率可能只有30%左右。而水凝胶珠柔软且可变形，紧密堆积在微流体通道中，因此可以保证~80% 的珠子占有率和~50% 的细胞捕获率的单泊松分布。
然而，10X的价格依旧昂贵，于是就有不通过细胞稀释，通过一些标记可以识别多个细胞的情况，以便后续将含有多个细胞的油包水液滴丢弃或在后续分析的时候识别出相关信息再丢弃，但都始终不能拿到多细胞液滴中每个细胞单独的转录本。
为了区分多细胞内各个细胞的转录本，可能的就是细胞之间已经携带了相关的Barcode，这让人想到了Split-seq技术。在之前《单细胞转录组方法篇——下》有提到，单细胞技术的发展实际上源于不用技术之间的交叉排列组合，没想到这次是Split-seq和油包水的技术结合在一起。
Split-seq虽然廉价且对仪器要求低，但是3轮的Split-Pool步骤极其繁琐，同时对于细胞有一定的损耗。该文章中细胞或细胞核被通透后，细胞被随机分到96 孔或 384 孔板上，在其中每个孔中打上同样的round1 Barcode。之后将细胞混合，将细胞过量的载入流道中，以便大多数液滴接收多个细胞或细胞核。每一个液滴中拥有round2 barcode。round1 条码在同一拆分池孔中的所有细胞之间共享，round2 条码在同一液滴中的所有细胞之间共享，但两个条码的组合唯一地标识了源自同一单个细胞的转录本。因此，在10X的一张8通道的芯片中，每个通道可以获得多达 150,000 个单细胞转录组。当然，选择384还是96孔板作为Round1引物，需要根据细胞数量而定，以防止在同一个液滴中出现两个相同的round1条码的细胞。
实际上，对于提高细胞捕获效率的优化一直在进行。在2019年5月份发表在nature communications上的文章，通过设计的微流控芯片，进行细胞磁珠的高效捕获。文章的目的是想对血液中的CTC进行单细胞的测序，无奈CTC在血液中的稀有性和10X的低捕获率正好冲突，于是设计了流体动力陷阱，或者说是差分流阻捕获。
每个腔室包含一个细胞捕获位点和一个约1nL体积的珠子捕获位点，由于 CTC 通常比其他血细胞大，因此细胞捕获位点设计为具有10×10µm的开口。该捕获孔允许较小的白细胞、红细胞和血小板通过，而较大的细胞（CTC 或较大的白细胞）可以被捕获。珠子捕获位点设计有一个开口为 20×25µm 的碗状捕获袋，以捕获平均直径为40µm 的珠子。腔室的入口、细胞捕获位点和珠子捕获位点可以通过由气动控制的不同Quake阀选择性地关闭，以进行细胞和珠子的配对操作。
在单细胞上进行流体动力陷阱的技术早在16年就已经出现，发表在16年nature communications上的文章，设计了细胞捕获芯片，该文章主要是可以在受控培养条件下进行多代谱系追踪后实现单细胞RNA-seq，即可以追踪细胞的分裂，可以获得各个代系细胞之间的转录组关系。图中左边的第一个原点为最初始的细胞，随着培养的进行，细胞开始分裂，分裂的细胞随着流道，进入下一个捕获孔，随着捕获孔被填满，后续分裂的细胞由于液流阻力的作用不会再进入已经捕获细胞的捕获孔，最终进入未捕获细胞的捕获孔。这样通过延时成像，可以了解到各个细胞之间的代系，再逆向流动，逐个收获单个细胞。
2020年4月，同样发表在Nature Communications上的，由国内杨超勇课题组发布的Paired-seq，也是使用了流体动力学陷阱的方式，进行高效率的单细胞珠子配对测序。在上样过程中，当捕获室为空时，沿直通道的流阻低于长环路旁路通道，主流沿直通道流动，导致流中出现单个细胞/珠被困在腔室中。被捕获的细胞/珠子的尺寸大于捕获室的孔口的尺寸，因此会阻塞局部流动，然后显着增加沿直通道的流动阻力。因此，主流重定向到旁路通道，随后的细胞/珠子将流入旁路流，进入下一个配对单元。这种捕获机制可确保在一个腔室中捕获的细胞/珠子不超过一个，从而实现了95%的捕获率。
文章开头提到，单细胞测序的本质是细胞和珠子的独立配对，传统的流道微流控的巧妙设计可以达到这一效果，如果可以通过类似微观镊子来高度平行自由的操控每个细胞和珠子，通过精确控制让细胞和珠子或者Barcode液滴走在一起实现配对，将大大提高效率。电润湿技术就是其中一种，利用介电润湿效应驱动液滴动作的原理在于通过对嵌在介电层下的微电极阵列施加电压来改变介电层与附着于其表面导电液滴间的润湿特性，使液-固接触角发生变化，造成液滴两端不对称形变，促使液滴内部产生压强差，从而实现对液滴运动的操作与控制以及对单细胞的捕获。下图为杨朝勇课题组在2020年12月发表于SCIENCE ADVANCES上Digital-WGS平台，对单细胞进行高效自动的全基因组测序。
另外，BerkeleyLights公司的Opto-Electro Positioning (OEP)技术，在Optical Tweezer（OT）光镊技术（利用激光形成陷阱，束缚微观粒子，并通过移动光斑移动微小物体）基础上进行优化，利用光束同时在光敏感材料上产生电势场，以低于OT技术万分之一的能量，实现大量单细胞的同时操作。该平台具有通量大，并行能力强，操控自由度高的特点，在小腔室中可以完成一系列包括转录组捕获，蛋白捕获或检测，代谢物检测等功能。
参考文献：
Kimmerling R J, Szeto G L, Li J W, et al. A microfluidic platform enabling single-cell RNA-seq of multigenerational lineages[J]. Nature communications, 2016, 7(1): 1-7. Zheng, Grace XY, et al. "Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells." Nature communications 8.1 (2017): 1-12. Zhang X, Li T, Liu F, et al. Comparative analysis of droplet-based ultra-high-throughput single-cell RNA-seq systems[J]. Molecular cell, 2019, 73(1): 130-142. e5. Cheng Y H, Chen Y C, Lin E, et al. Hydro-Seq enables contamination-free high-throughput single-cell RNA-sequencing for circulating tumor cells[J]. Nature communications, 2019, 10(1): 1-11. Zhang M, Zou Y, Xu X, et al. Highly parallel and efficient single cell mRNA sequencing with paired picoliter chambers[J]. Nature communications, 2020, 11(1): 1-13. Ruan Q, Ruan W, Lin X, et al. Digital-WGS: Automated, highly efficient whole-genome sequencing of single cells by digital microfluidics[J]. Science advances, 2020, 6(50): eabd6454. Datlinger P, Rendeiro A F, Boenke T, et al. Ultra-high-throughput single-cell RNA sequencing and perturbation screening with combinatorial fluidic indexing[J]. Nature Methods, 2021, 18(6): 635-642.
Seurat4.0系列教程21：结合Cell Hashing分析双细胞
Rethinking batch effect removing methods—各种NMF
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