小鼠早期原肠化的转录异质性和细胞命运决定的scRNA-seq图谱
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文章信息
文章题目：Single-Cell Landscape of Transcriptional Heterogeneity and Cell Fate Decisions during Mouse Early Gastrulation
期刊：Cell Reports
日期：2017年8月
DOI: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.07.009
Introduction
小鼠围着床期胚胎由外胚层（epiblast）和两个胚外胚层（滋养外胚层（TE）和原始内胚层（PrE））构成，植入约发生在E4.5，标志着胚胎发生了关键变化。多能性epi 植入后发生动态变化，发育为一个转录特异的存在并为分化做好准备。这导致了原肠化谱系产生。原肠始于原始条纹样胚胎（PS）的形成。
囊胚形成后，胚胎发育的一个早期里程碑事件是胚胎着床前外胚层和PrE的形成。这一谱系决定过程主要受信号机制驱动，尤其是Fgf/Mapk信号通路。Fgf的调节水平直接决定谱系发生，scRNAseq研究证实了该信号通路驱动PrE身份的产生；在次一级的谱系特化发生前，epibalst发生了转录重组和细胞数扩增的过程。该过程中，epi受到协调信号诱发，建立起轴向极性。Wnt，Tgf-b，Fgf信号是驱动分化 和pattern建立的主要动力，是PS 形成和原肠化必不可少的因素。与此同时，PrE进一步分化产生位于epibalst之上的内脏内胚层（VE）。VE 的调控信号影响epi的细胞命运，尤其是通过促进或拮抗信号通路，如Wnt、Nodal ，以限定区域的方式定位和标记PS 和其他胚胎亚谱系。
这些阶段中一个显著变化是雌性胚胎X染色体重激活和再次失活。父本X染色体在2-4C期间失活，着床时在epi中重激活。随后，两条X在原肠化前某一条随机失活。Xist及相应的调控因子在该过程中有重要作用。多能性相关TF如 pou5f1 sox2 nanog在X重激活中发挥作用， 部分下调了Xist的转录。ESC和EpiSC的scRNA 提供了解析新角度，提出了一些调控XC的新基因。
细胞命运决定的几个原则已经确立，包括关键转录因子网络、细胞信号传导、细胞位置和运动以及机械力的作用，然而细胞在体内如何从一种“fate” 实际过渡到另一种还不清楚。
某些情况下可以发现转录异质性先于谱系分离出现，这种现象被认为有助于打破对称性。异质性如何产生及对破坏对称性作用多大尚不清楚。Oct4 Cdx2分别对应于ICM和TE，PrE和Epi 基因在E3.5ICM共表达，E4.5开始限制于特定细胞。
本文E3.5-6.75（数据中包含，文章没写）可以部分解决以上问题。
Results
E3.5, E4.5, E5.5, and E6.5胚胎转录谱系鉴定
选择着床前E3.5 胚胎ICM，和E4.5-6.5的epi 和PrE进行测序。根据标准（>4000 genes; <10% MT，表达(>1 count)TE markers( Elf5, Wnt7b, and Tex19.1)的细胞删除）进行质控。128个细胞可能为双细胞，不过不影响结论。结果显示数据按照发育点分离，可以匹配谱系对应的markers。
为严格确定谱系表示和对应的markers，采用SC3 进行分析。数据包含了所有表达的基因、表达的lnc和TF（fig1d，但是我认为有点问题，基因不会这么少），鉴定出8个cluster及对应的基因集，区分了胚内外组织，并在E6.5鉴定出4个亚群。E3.5如前报道，并无谱系分离，表达一些已知的naive markers。E4.5，细胞可清晰分为epi和PrE，对应markers一并表达。E5.5，epi与E4.5 epi分开聚类，Nanog表达减少，Primed markers（Pou3f1）开始表达；该天的epi并未分出任何亚群。E6.5 细胞分为4群，分别为VE，PS，两群epi；PS 鉴定由表达Snai1、Lef1、Evx1、Mesp1，高表达T而来。还有一些其他PS markers：Greb1, Ncoa5, Eid1和H2afy2。GO分析显示，发育过程中Wnt、Bmp、Fgf和Nodal等信号通路的作用越来越强，这些通路活性在PS cluster中尤为活跃。
这些阶段的多能性markers展示在fig 1E。E3.5呈现最高的naive基因活性，其次是E4.5。E5.5和6.5，胚胎不再表达naive markers，转而表达primed markers。E4.5-6.5的epi 多能性基因表达显著不同，但相对缺乏明显的分化特征，这可能表明分化前细胞多能性已经转为formative（这里最好是用所有epi去做一个类似于1E的图）。许多markers在胚胎中并非均一表达，如E3.5，Klf4 和Fgf4 不像Nanog和Sall4均一表达；E4.5 Utf1和E6.5 的T 和Cer1亦如是。
X染色体在激活的随后的失活
两性多枚胚胎的存在使得研究早期发育中潜在的性别差异成为可能。分析Y染色体基因表达确定每个胚胎的性别。比较雌雄间的常染色体和XC发现在E3.5 雌性胚胎中XC表达开始增加（2A），这种差异在E4.5-5.5变得明显，在E5.5开始失活XC，E6.5时雌性胚胎XC表达就降低到与其他常染色体相同水平。scRNA分析这个异质性还是给力（后续借鉴）；胚外组织没有明显的XC差异，即父系XC并未激活，雌雄细胞XC表达相近（2B）。
因此，作者探索了胚胎谱系中基因表达水平与XC激活状态之间的相关性，以识别与这一过程相关的基因，并表征与已知调控因子的关系。多能因子Pou5f1、Nanog和Sox2被认为是XC再激活的关键调控因子。作者发现XC再激活与E3.5处的Pou5f1表达水平正相关（2C），尽管这一结果在多重矫正后并不显著；Pou5f1 与失活后XC表达水平负相关，这一结果可能是PS高表达Pouf1的特征，即谱系自身的特征，而非是XCI的关系（作者生圆回去了）。Nanog和Sox2与再激活或失活过程均无明显相关性。评估了其他几个候选因子，top100候选中出现了与Pou5f1 互作的转录因子如Zfhx3和几个锌指蛋白如Zfpm1、Zfp180和Zfp60（2DE）。
因为再失活在E5.5开始，故在该阶段可以揭示失活的潜在驱动因素。与E5.5处X染色体失活相关的top基因是DNA甲基转移酶Dnmt3a和转录抑制因子Zfp57，Dnmt3a和Zfp57已被证明相存在互作，Dnmt3a已被证明调节Xist表达；Zfp57的表达与X染色体水平在X再激活和X失活时均呈负相关。失活进一步与其他几个基因相关，包括染色质和转录调节基因，如Mnt, Zfp444, Lass4, Lin28a, Hsf1, H2afz，和Nr1d1；热休克转录因子Hsf1参与精子发生减数分裂，抑制该过程X和Y染色体的失活，X染色体上的组蛋白H2afz也参与了失活；E5.5处的XCI也和Rlim 表达减少相关，该基因是一种泛素连接酶，此前被认为与调节X染色体失活有关。
系统评估转录噪音
组织内存在异质性表明不同细胞进行协调转录；如果细胞类型内出现异质性则表明存在转录噪音或细胞产生变异。选择匀质细胞群，即E3.5-5.5的ICM和epi，从E6.5 PS中分离了epi，选择了物理位置上的前端epi。
随后计算了成对细胞间的转录噪音，用以判断细胞异质性。方法如下：
1.计算CV 来获取高变基因；
2.根据公式：
计算转录噪音，ρ为top500高变基因的细胞spearman相关度。（现在这种评估转录噪音的方法用的少了，肿瘤里面用的多，主要是肿瘤里的亚群琐碎且难分，现在seurat 的算法聚类效果很好了）。
当噪音降低时，细胞趋于相似。E3.5 的ICM（“uncommitted ”）转录噪音高于E4.5 的epi（“committed ”）（3B）；PS中转录噪音降低，表明伴随着谱系分离与分化，转录噪音越来越低（我直观理解，就是熵减）。E6.5 epi（“uncommitted ”）相比E5.5 epi （“committed ”）噪音增加，表明其位于多能性退出的关口，这一情况在不同批次中得以复现，表明方法可靠。E6.5 epi也高于PS。
随后计算了细胞周期对应的转录噪音。这个见仁见智，我认为早期胚胎发育细胞周期时必须要考虑的点，且将之当成细胞本身异质性即可，不需要回归掉。因本阶段细胞本身的周期就不同。是自身属性。
Epi 和PrE转化中的对称性破坏
在E4.5，确定epi或PrE身份的转录网络出现之前，特异的PrE及epimarkers 在E3.5处已共表达，然后在形成PrE和epi之前形成成“盐和胡椒”模式（就是黑白掺杂）。这种模式使得在谱系特有表达模式出现之前，以一种不协调的方式共同表达相反的谱系markers。作者研究了E3.5到E4.5的谱系分离：在E4.5，细胞分离成两个清晰的亚群即epi和PrE。这俩亚群在E4.5的DEG鉴定出689个PrE基因和382个epi基因。尽管E3.5没有观察到亚群，但PrE和外胚层部分基因已经表达。这表明存在早期（E3.5）和晚期（E4.5）的谱系表达波。与以上结果一致，epi和PrE markers，如Nanog/Sox2 和Gata6/Sox17，在E3.5以不基于谱系的方式随机表达（4A），在E4.5以互斥的方式表达前二者在E3.5大量共表达（4B），故而E3.5无法区分谱系。此外，E4.5一个群也表达两个谱系markers，但此类细胞同时表达早晚期markers，这和ICM不同，故后续分析下排除之（不是双细胞）。
利用以上定义的谱系基因，分析E3.5-4.5 细胞PrE和epi 基因表达比例（4C）。E3.5表达两种markers，E4.5细胞倾向于其中一种。为解决细胞如何打破E3.5 的匀质性问题，鉴定了表达水平与epi基因和PrE基因表达比例相关的基因，并假设这些基因可能是代表谱系决定的关键驱动因素（4D）。采用这种方法，鉴定出Fgf4和Fgfr2 ，证实了方法的可用性。随后发现，Pdgfra、Top2b、Sox17、Gata4和Pdk2与向ICM向PrE细胞转变有关；同样，Morc1、Nanog、GM10664、Dppa5a和Pdpn与epi转变有关。E3.5胚胎分析表明，对称性的打破并不反应个体之间的发育差异。
随后采用EnrichR 对上面提到的基因集进行富集分析（这是个TF预测数据库）。结果显示epi可能受到多个多能性因子调控，如Nanog和Oct4。EPI和PrE基因都富集到可被多梳结构如Ezh2和Suz12结合。发育基因被认为是受二价染色体标定调控，如H3K27me3 and H3K4me3，故作者用ESC中定义的区域分析了PrE和epi基因的组蛋白富集程度。结果显示PrE和epi都显示二价富集，且在晚期谱系中比例增加。为探索二甲染色体标定的早期谱系噪音基因和更接近的晚期谱系基因，作者分析了这俩组蛋白在ICM中的数据用以量化本文数据。分析了H3K4me3和H3K27me3数据，匹配对应的epi和PrE基因发现，与晚期基因相比，早期基因的H3K4me3水平显著升高，晚期基因的H3K27me3相对富集，这表明ICM中晚期谱系基因（受抑制），但H3K27me3水平高于早期基因(有活性)（4F）。双价活性基因被认为与转录噪音（异质性）增加相关。
这一段不好理解，大意是多能性相关和分化相关基因与常染色质异染色质相关，然后这里有俩epi和pre的基因集，找了个ICM的组蛋白数据分析这俩基因集富集俩组蛋白的比例，比一下就知道谁常染色质多谁异染色质多。
多能性退出和谱系稳定
从E5.5到E6.5的转变的特点是，在未定义的epi部分，转录噪声增加，同时PS的噪声显著降低。随着primed相关基因的表达增加，还观察到naive相关基因的表达减少。尽管表达了与前后极性和PS相关的信号成分，如Cripto、node和Lefty1，E5.5的epi没有明显的亚群或PS markers 表达。这表明，在这个阶段，只有少数关键调控因子可能是不对称表达的，这足以形成不对称pattern。
E6.5细胞进行聚类，可以发现胚内外之别。Hhex、Cer1、Lefty1和Dkk1可以进一步对VE进行分析，可鉴定出AVE。通过检测pattern和Cer1相关基因发现，CD24a 和Wnt拮抗剂 Sfrp1等markers与AVE相关，而Tdh、Sord和Wnt 相关基因 Srebf2等基因在非AVE cluster中富集。进行DEG发现，epi包括三个亚群，即PS 和俩epi亚群（5A）。这俩亚群区别不大。E6.5胚胎中的T阳性细胞既为Mesp1阳性，也为Mesp1阴性。在PS群中上调的基因包括已知的PS和中胚层markers，如Mesp1、Mesp2、Bmp2、Snai1、Gata4和Gata6，及其他一些markers，如Greb1、H2afy2、Eid1和Ncoa5。在PS基因的启动子区域中富集到Mixl1、Pou5f1和Foxh1的motif（还是公共数据的组蛋白数据）表明这些转录因子可能推动了中胚层发生。在epi中，Otx2表达明显增加，其他一些促癌基因表达也明显增加。分析该时期H3K27me3 chip发现，与epi其他部分相比，多梳结合基因在PS 中显著上调（5C）。这说明多梳复合物在建立非定向epi的转录控制中发挥作用，包括调节PS发生过程，该发现与Eed敲除胚胎的表型一致。
Discussion
提出几个点，E4.5-6.5的谱系markers；多能性向原肠化的表观及信号事件；X在激活再失活；转录噪音（熵），每个点的细胞周期。
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