对抗T细胞耗竭的治疗可能会降低白血病的复发率
急性淋巴细胞白血病患者得益于嵌合抗原受体T细胞和双特异性T细胞结合因子的出现，预后有了明显的改善，但是仍有一些患者会出现复发的情况。T细胞耗竭最近被认为是这些患者复发的一个重要驱动因素。事实上，表型耗尽的CD4+T细胞预示着B-ALL的复发和总体存活率较低。因此，对抗T细胞耗竭的治疗，如免疫检查点阻断，可能会改善白血病的免疫监视，防止复发。本文使用Ph+B-ALL小鼠模型和人类骨髓活检样本来评估CD4+T细胞耗竭的基本性质，以及将基于抗PD-L1的检查点阻断与针对BCR-ABL癌蛋白的酪氨酸激酶抑制剂相结合的临床前治疗潜力。
B-ALL小鼠模型表现出T细胞表型衰竭的特征
为了研究T细胞耗竭和白血病免疫逃逸的机制，构建B-ALL小鼠模型，其中CD4+和CD8+T细胞均出现表型耗竭。耗竭性CD4+T细胞失去了合成肿瘤坏死因子的能力。在使用Nur77 GFP受体小鼠来评估CD4+T细胞表型耗竭是否需要同源抗原的TCR参与时，结果显示表型耗竭与白血病抗原的TCR识别密切相关。
图1：白血病诱导活化的T细胞出现耗竭表型
PD-L1靶向治疗联合BCR-ABL抑制可延长生存期
白血病的建立会迅速导致T细胞表型耗尽，为了验证免疫检查点阻断治疗是否能提供治疗益处，构建白血病小鼠治疗模型，结果发现尼洛替尼和PD-L1联合治疗确实显著延长了小鼠的存活时间，在重复实验中约有70%的小鼠长期存活。尼洛替尼单独治疗后90%的小鼠复发。这种快速复发也发生在只接受尼洛替尼治疗并耗尽了CD4+T细胞的三只小鼠身上。从早期进展的垂死小鼠的脾中提取基因组DNA，并对BCR-ABL酪氨酸激酶结构域进行Sanger测序。这揭示了众所周知的酪氨酸结构域逃逸突变的普遍存在，包括T315I和E255K，在早期发展为白血病的六只小鼠中。因此，PD-L1靶向单抗治疗似乎在很大程度上克服了这种常见的临床耐药机制。尼洛替尼和PD-L1治疗后长期存活的小鼠再次注射了LM138细胞。研究的结果表明，保护性记忆反应足以防止约78%的长期存活小鼠重新建立白血病。
图2：尼洛替尼联合PD-L1阻断以依赖于CD4+T细胞的方式诱导保护性抗白血病免疫反应
ScRNAseq揭示了白血病发生和治疗过程中产生的多个CD4+T细胞亚群为了研究白血病激发和PD-L1治疗对骨髓和脾中CD4+T细胞的影响，该研究进行了单细胞RNAseq/Cite-Seq/TCRseq。同时从5个平行治疗组中分离和捕获CD4+T细胞，对分选的细胞进行CD44阳性浓缩。第一组小鼠接种热致死白血病疫苗。第二组小鼠没有接受治疗，在注射白血病后第16天进行了分析。第三组和第四组小鼠注射白血病后第14天分别给予尼洛替尼或尼洛替尼加抗PD-L1单抗治疗2周。第五组小鼠是长期存活的小鼠，这些小鼠已经成功地接受了尼洛替尼和抗PD-L1单抗的治疗。对5组数据进行整合确定了13个CD4+T细胞亚群。
图3：单细胞RNA测序显示白血病小鼠中存在不同的CD4+T细胞亚群
PD-L1靶向治疗扩大了具有T辅助和细胞毒功能的白血病特异性CD4+T细胞克隆
scTCR-测序结果显示，当白血病被清除或低于可检测到的水平时，TCR多样性增加。Thctx-ex细胞中单个TCR克隆显著扩增。在第4组小鼠的Thctx-ex中，约有一半的T细胞表达一个显性TCR。比较表达主要TCR克隆型的Thctx-ex细胞与所有其他Thctx-ex细胞的基因表达模式发现，表达主要克隆型的T细胞上调了与辅助/效应器功能相关的细胞因子、趋化因子和受体。同样，表达优势克隆型的T细胞也表现出最强的抑制性受体下调。因此，表达这种主要TCR克隆型的CD4+T细胞似乎表现出强大的效应功能。扩增的CD4+细胞增加了T辅助分子的表达，与CD8+T细胞中GZMB阳性的增加相一致，这表明PD-L1单抗治疗最终可能同时增强CD4+和CD8+T细胞的活性。
图4：白血病诱导独特的T辅助细胞/细胞毒亚群，受尼洛替尼和抗PD-L1抗体的影响
人类B-ALL患者确诊时存在CD4+Thctx-ex细胞
为了研究B-ALL患者的表型耗尽T细胞是否与在小鼠模型中观察到的T细胞相似，对5名不同患者的诊断骨髓活检样本中分离的T细胞进行了scRNA-seq分析。ScRNA-seq鉴定了一小群表达细胞毒相关转录本的CD4+T细胞。与小鼠Thctx-ex细胞一样，该簇显示了激活/耗竭标记以及趋化因子受体的相对过表达。流式细胞仪分析表面蛋白标记物证实存在少量GZMB+CD4+T细胞，并优先表达TIM3。因此，表型耗竭的标志物确定了B-ALL患者中表达与在小鼠模型中观察到的Thctx细胞类似的核心转录程序的Thctx细胞群体。
图5：在人类B-ALL患者中观察到辅助性/细胞毒性耗尽的CD4+T细胞
B-ALL可诱导出具有细胞毒和辅助功能的独特的CD4+T细胞亚群。联合应用酪氨酸激酶抑制剂尼洛替尼和抗PD-L1可显著提高白血病小鼠的长期存活率。在治疗前耗尽CD4+T细胞完全丧失了生存益处，这意味着CD4+T细胞是保护性抗白血病免疫反应的关键驱动因素。事实上，抗PD-L1治疗导致具有上述辅助/细胞毒性表型的白血病特异性CD4+T细胞的克隆性扩增，以及衰竭标志物的表达减少。这些发现支持在临床试验中利用PD1/PD-L1检查点阻断的努力，并强调需要进一步研究以了解细胞毒性CD4+T细胞在血液系统恶性肿瘤中的起源和功能。
参考文献
Tracy Sean I,Venkatesh Hrishi,Hekim Can et al. Combining nilotinib and PD-L1 blockade reverses CD4+T-cell dysfunction and prevents relapse in acute B-cell leukemia.[J] .Blood,（2022）.10.1182/blood.2021015341
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