正交coiled-coil蛋白相互作用工具包大显神通
▉ 原文信息
今天给大家带来一篇最近发表在 Nature chemical biology（IF=12.154） 上面的一篇文章，文章的作者 Roman Jerala. 他是来自于斯洛文尼亚国家化学中心的合成生物学与免疫部门，在研究分子识别机理和药物设计方面具有很高的成就。本文的研究也是他最为擅长的领域之一。
▉ 前言
1.蛋白与蛋白相互作用可指导蛋白质的异源或同源寡聚，在蛋白质的信号传导、转运、支架和其他许多细胞生理过程中起着关键作用。比如我们所熟知的亮氨酸拉链蛋白（leucine zipper），两条同源且相互平行的短多肽通过亮氨酸产生粘附力，从而具有调节生理活动的功能。蛋白质相互作用区域的模块化能够得到各种不同功能组合，为生物系统的设计提供了便利。
2.相互正交的蛋白相互作用模块，一般是异源寡聚蛋白。在复杂哺乳细胞内的生理活动中具有更多元，更有效的调节方式。但是目前可用的正交肽对的数量有限，限制了可能同时引入细胞的不同相互作用的范围。
3.作者基于以上理论与不足，通过合理设计，得到6组相互正交的 coiled-coil 异源多肽二聚体（NICP set）相互作用的模块，然后通过这些模块在哺乳动物细胞里调节不同的生理过程。
▉ 内容
a| 在哺乳动物细胞中验证6组NICP set的正交性
作者将这12个设计的多肽分别融合表达在转录激活因子(TALE) DNA结合区域(DBD)的C端和转录激活区域(TAD) VP16 的N端。TALE-CC在启动子的上游，当有VP16激活时才能表达荧光报告基因。实验证明荧光蛋白仅在TALE-CC与其相对应的CC-VP16相互作用时表达。也就是说在图中P1只和P2配对，P3只和P4配对，以此类推证实了6组模块的正交性。
在转录激活因子(TALE)DNA结合区域(DBD)的C端融合表达两段CC多肽(P3和P5),当加入没有NLS的转录激活区域VP16-P4时，报告基因很少被激活。（NLS：核定位序列）。然而当共转NLS-P6时，P5与P6结合，同时在NLS引导下进入细胞核，导致报告基因被激活。
作者观察到不同的CC肽模块在转录激活的强度不同。于是他们想验证一下能否针对特定一对CC肽模块通过改变肽的结构，进而调节转录激活的能力。如上图a,将P3和P4重要相互作用的氨基酸进行突变，得到P3S和P4S变体，结果可以看出转录激活能力有一个范围值。然后作者通过增加CC肽模块以及转录激活因子的数量，同样也得到了一组不同激活能力范围的范围值。如上图b.
作者依据目前提高转录激活的CRISPR–dCas9系统，创造性的在dCas9蛋白融合表达10段P3重复序列，命名为“CRISPR-CCC.如图所示，在激活因子VP64存在时激活效率明显高于原来的CRISPR–dCas9系统以及最近研究较热的Suntag系统。如果再引入更强的激活因子VPR，激活效率进一步增强。
1.首先复习一下条件转录：转录激活因子(TALE) DNA结合区域(DBD)和转录激活区域(TAD)分别融合表达一个结构域，这两个结构域的靠近需要通过中间的化学或物理信号分子参与。 如图a，同样是CRISPR–dCas9系统，只不过在Cas9蛋白上融合表达PCID2，在TAD上融合表达PCID1。当引入刺激因子（图中五角星）这两个结构域结合，激活转录。比如较为熟知的雷帕霉素诱导的FKBP与FRB的结合；ABA诱导的PYL1与ABI的结合；光照诱导的CRY2与CIBN的结合。
2.作者也是利用这三种模式，通过利用CRISPR-CCC系统发现，该方法的条件转录调控激活的效率远高于之前的方法。▉ 亮点总结
1.开发了6对可用于真核细胞的正交的coiled-coil工具包。大大扩大了可同时引入细胞的不同相互作用的范围。
2.相比于其他转录激活方法，该技术具有更高的激活效率，而且具有较宽的可调节的范围。
3.开发了CRISPR-CCC转录激活平台，可较大程度提高转录激活和条件转录激活的效率。
本文作者王永，北京大学医学部博士在读，微信(id:xs2014233)。目前已经有近400人药学交流群（好学，有趣且奔波于药学圈人才聚集于此）。进群加作者微信或者扫描二维码添加作者，此群仅为科研交流群，非诚勿扰。
文中图片、封面图片来自网络，如因版权等有疑问，请于本文刊发30日内联系药学速览。
原创内容未经授权，禁止转载至其他平台。