清华大学鲁白团队开发全球首个全面模拟人类阿尔茨海默症的大鼠模型

▉ 研究背景

阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease，AD）是一种严重的神经退行性疾病，最终导致痴呆。世界卫生组织预测全球痴呆患者到2050年将超过1.5亿。AD患者大脑中β－淀粉样蛋白（beta-amyloid，Aβ）异常聚集、含tau蛋白神经原纤维缠结以及神经元大量凋亡伴随胶质细胞增生是其主要病理学特征，具有记忆力、人格和其他认知功能的进行性损害，严重影响社交、职业与生活功能，带来了沉重的社会负担。

http://thesilverbird.com/alzheimers-disease-symptoms-causes-treatment/

目前全球已经开展了400多项AD药物临床试验，但迄今为止尚无一个阻止AD进程发展的药物可用。主要障碍之一是缺乏能够完全展现AD疾病发病机制的动物模型，导致有很多候选药物在动物模型中有效，但在AD病人的临床试验中则无效。

以往，大多数 AD 模型通过采用各种各样的转基因技术，将不同突变型的人类Aβ的前体App基因过度表达在小鼠中，如PDAPP，Tg2576， APPswe/PS1M46L, APPswe/PSEN1dE9，和5× FAD小鼠，然而，这些转基因动物模型几乎没有神经元死亡，没有 tau 蛋白过度磷酸化，并且没有看到在人类 AD 大脑中异位脑区出现的 Aβ 病理学。这在很大程度上妨碍了对AD的研究和临床药物开发。建立人源化、能够全面模拟人类AD的动物模型，一直是AD领域机制研究和药物开发亟需解决的一大难题。

图源：《Recent Perspective About the Amyloid Cascade Hypothesis and Stem CellBased Therapy in the Treatment of Alzheimer's Disease》

近日，由著名神经科学家、清华大学药学院鲁白教授团队，在该领域实现了重大突破，成功开发了能够全面模拟阿尔茨海默症的基因敲入大鼠模型，相关成果以Article形式在线发表于 Cell Research 期刊。

▉ 方法与结果

鲁白教授团队采用CRISPR/Cas9基因敲入技术生成了一个包含Swedish-Beyreuther/Iberian-Arctic突变的App敲入大鼠品系（App^NL-G-F），避免了使用转基因技术过度表达App而导致的非生理表型。

该大鼠模型与现有其他AD动物模型相比，展示了一套全面的AD相关病理、细胞和行为表型，与人类AD患者显示出更相似的病理特征，这在其他APP模型中很少见。

http://www.sps.tsinghua.edu.cn/cn/news/achievement/2021/1119/794.html

Aβ 寡聚化是形成Aβ 斑块的关键中间状态。AD 的标志之一是大脑中存在 Aβ 斑块。使用与 Aβ 斑块特异性反应的抗体（OMAB），在出生后 1 个月纯合子和 4 个月的杂合子雄性大鼠检测到 Aβ 沉积的痕迹。纯合子大鼠的 Aβ 沉积大约是杂合子大鼠的三倍，并且以年龄依赖性方式增加。研究人员还检查了雌性纯合大鼠的 Aβ 斑块。雌鼠中的 Aβ 沉积也表现出年龄依赖性增加。有趣的是，似乎在检查的三个大脑区域（Hippocampus, Cortex和Subcortical）中，雌鼠的 Aβ 沉积进展速度比雄鼠快，尤其是在6月龄之后。

App^NL-G-F大鼠小脑中大量 Aβ 寡聚体、斑块、它们的时空分布和缺乏 Aβ 沉积的存在与在人类 AD 大脑中观察到的淀粉样蛋白病理学大体相似。

JAMA. 2015;313(14):1488. doi:10.1001/jama.2015.2852

其次，AD患者大脑中，tau蛋白过度磷酸化导致神经原纤维缠结 (NFT），而在以往几乎所有的App小鼠模型中都缺少tau病理表型。鲁白教授团队通过WB蛋白印迹，光密度测定和免疫印迹方法检测tau 磷酸化水平和聚集程度（APN-mab005，MC1和APN-1607），证明敲入App突变可能导致App^NL-G-F大鼠模型中tau 病理学的形态学和生化变化，与人类的高度磷酸化的tau，以及病理性tau蛋白聚合物高度相似。

另外，作者在蛋白水平和形态上发现6、9和12月龄纯合App^NL-G-F大鼠大量神经胶质细胞增生是由于小胶质细胞和星形胶质细胞增殖的增加，而不是神经胶质细胞死亡的减少，12月龄杂合子Iba1 (小胶质细胞marker) 和 GFAP (星形胶质细胞marker)  也有少量显着增加，而且通过共定位分析发现胶质细胞的积累似乎在Aβ斑块周围高度集中。说明App^NL-G-F大鼠脑中也有显著的神经炎症，与AD患者大脑类似。

AD进展进程中，突触数量减少以及突触功能受损，发生在 Aβ 积累之后。作者通过对App^NL-G-F大鼠脑中分离突触体进行的生化和突触面积和周长量化的突触损伤表明，突触素和 PSD-95（突触前和突触后标记物）的水平分别显着降低，表明AppNL-G-F大鼠脑中存在突触损伤。

通过不同年龄段的AppNL-G-F大鼠分析发现其突触损伤可能在 3 至 6 个月大时开始。该AppNL-G-F大鼠动物模型的建立，将成为验证目前公认的基于突触修复的新型治疗策略的有效工具。

由神经元丢失引起的脑萎缩是AD患者的另一个突出病理特征。然而，在App转基因或基因敲入小鼠中均未观察到神经元丢失。而在App^NL-G-F大鼠海马中出现了大量神经元丢失，在 12 个月和 22 个月大的纯合App^NL-G-F大鼠中，NeuN 阳性神经元的数量分别减少了约 30% 和 50% 。在冠状切片中，与WT同窝仔鼠相比，12个月大的纯合App^NL-G-F大鼠的侧脑室扩大可见。作者使用 MRI扫描仪，获取了T2 加权解剖图像以量化脑室系统的体积差异，通过对脑室系统进行表面渲染3D重建，三个正交视图以及左右侧脑室的量化分别证明双侧侧脑室的扩大。此外，App^NL-G-F大鼠脑的大小和重量也减少了，定量分析显示，12个月大和22个月大的纯合子大鼠的整体脑重量分别下降了9.11%和16.09%。

因此，App^NL-G-F大鼠表现出进行性神经元丢失和脑萎缩，类似于AD 患者。这也是科学家首次在AD患者以外的动物模型中观察到脑室扩张，该App^NL-G-F大鼠为研究这一问题提供了工具。

Nat Neurosci. 2014 May;17(5):661-3. doi: 10.1038/nn.3697. Epub 2014 Apr 13. 

2014年，日本科学家Saido研究组用几乎完全相同的策略，制作了基因敲入型App^NL-G-F小鼠模型。鲁白教授团队将其研发的App^NL-G-F大鼠与Saido组的App^NL-G-F小鼠进行了年龄匹配的比较研究。发现与App^NL-G-F大鼠不同，App^NL-G-F小鼠AT180/tau5磷酸化没有增加，对凋亡标志物Bax/Bcl2和cleaved-caspase3 的分析未显示任何凋亡迹象，即神经细胞没有坏死性凋亡。该结果提示App^NL-G-F小鼠模型欠缺AD患者大脑中的最关键的病理特征，App^NL-G-F大鼠是更接近AD患者的动物模型。

最后，作者通过对App^NL-G-F大鼠进行多种行为实验评估发现，发现5个月大时App^NL-G-F大鼠空间记忆明显缺陷，这与突触缺陷发生在3至6个月大之间的数据一致。AD患者更典型的表型是情景记忆缺陷，即对先前经历的回忆以及时间、地点、相关情绪方面的有缺失，研究人员使用配对联结式学习(PAL)测量任务，证明App^NL-G-F大鼠的物体定位关联学习能力显著受损，具有明显的情景记忆障碍。此外，通过对大鼠和小鼠在衰老病理方面的比较，包括代谢、心血管和神经系统，表明大鼠更适合老年相关疾病的模型，因此，大鼠更适合复杂的行为研究，尤其是那些与AD相关的研究。

▉ 总结

http://www.sps.tsinghua.edu.cn/cn/news/achievement/2021/1119/794.html

与小鼠模型相比，App^NL-G-F大鼠模型提供了一些独特的优势，使用App^NL-G-F大鼠模型更有利于进行药物研究、生物标志物发现和各种组学研究。

论文链接： https://www.nature.com/articles/s41422-021-00582-x

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编辑人：宁帅同学

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