总结 | 蛋白胞内递送的纳米载体介绍
前言
蛋白质/抗体疗法通过替换体内具有缺陷、体内缺失的蛋白而发挥治疗作用，在低浓度时仍表现出高特异性和高活性。1982年美国食品药品监督管理局（FDA）批准的胰岛素，就是一种能够有效治疗I型和II型糖尿病的蛋白质疗法。这是一种富有前景的治疗方法，具有巨大的市场潜力。据估计，至2019年底，包括用于诊断、预防、治疗的蛋白质药物在内，全球生物工程蛋白质药物的市场价值约达2227亿美元。
然而，易于聚集和失活、易于引发机体免疫应答等不利的理化性质成为蛋白质递送中的一大难题。近年来，纳米药物递送系统的发展成为这一难题的有效解决方案。基于此，本文综述了用于递送蛋白质药物的纳米载体，主要包括聚合物纳米颗粒（天然多糖和合成聚合物）、脂质纳米载体、蛋白质复合物、细胞穿透肽纳米载体、基于外泌体的递送系统、金属有机骨架（MOF）复合物以及无机纳米颗粒（二氧化硅、金、磁性骨架和碳骨架）。
图1 用于蛋白质胞内递送的不同纳米载体
聚合物纳米载体
众所周知，聚合物分为天然聚合物和合成聚合物，壳聚糖、细胞糊精、海藻酸钠、右旋糖酐及其衍生物等多糖，是一类重要的天然聚合物，广泛用于蛋白质的胞内递送。
1.多糖纳米载体
壳聚糖（CS）是一种天然多糖，广泛应用于生物医学领域。浙江理工大学姚菊明课题组于2017年报道了一种L-缬氨酸（LV）和苯硼酸（PBA）修饰的多功能羧甲基壳聚糖纳米颗粒（CMCS NPs）。这一体系能够在高浓度葡萄糖刺激下“触发释放”胰岛素，同时保护胰岛素不在模拟胃液、肠液环境中降解，从而实现对胰岛素的高效递送。（图2a）
图2 CMCS-PBA-LV多功能纳米载体用于胰岛素的口服递送
2.合成聚合物纳米载体
细胞穿透性聚二硫化物（CPDs）最初于2013年由Matile团队研发，其粒径可通过改变聚合时间、引发剂和单体浓度进行调节。新加坡国立大学姚少钦团队于2015年报道了一种谷胱甘肽（GSH）辅助解聚的CPDs，因包含具有硫醇基的引发剂，其在胞质中GSH的作用下能够迅速降解，从而高效递送蛋白质。硫醇基引发剂的结构如图3a所示。
图3a AO-SH和Tz-SH引发剂的结构
中国科学院国家纳米科学中心聂广军团队于2017年报道了一种脂质-肽段作外壳的胶束用于抗体和多柔比星的共递送（图4），其外层的脂质-肽段可被金属蛋白酶2（MMP2）降解，进而高效释放所载药物。
图4 MMP2响应释药型胶束
脂质纳米递送系统可由天然、半合成或合成脂质材料构建而得，根据结构和组成的不同，可将其大体分为固体脂质纳米颗粒（SLNs）、脂质体、纳米乳和纳米胶囊。目前，已有用于蛋白质或肽类药物口服递送的脂质纳米递送系统取得商业成功。
脂质体是具有水性内腔的双层囊泡。基于其特殊的结构，脂质体既能够负载亲水性药物又能够负载疏水性药物，并通过内吞作用或脂质体-细胞膜融合作用将药物递送入胞。迄今为止，已有多种载有小分子药物的脂质体获得FDA的批准应用于临床。
中国药科大学周建平以及浙江大学顾臻团队于2014年报道了一种凝胶-脂质体复合物用于肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）和阿霉素（DOX）的共递送（图5），这一策略表现出良好的抗肿瘤效果。
图5 TRAIL/DOX凝胶-脂质体递送系统
2. 固体脂质纳米颗粒
固体脂质纳米颗粒的生物降解性和生物相容性良好、化学修饰易于进行，而且能够被细胞快速摄取，因此也可作为一种富有前景的亚微米基因/蛋白质递送系统。
无机纳米颗粒的尺寸调节和表面修饰均易于实现，蛋白质可通过共价或非共价作用被稳定地包封其中。通常而言，这些纳米颗粒通过内吞或膜融合机制内化入胞，其负载的蛋白质会经历内体逃逸过程，也可能直接进入胞质或其他细胞器。
FDA将二氧化硅认定为“通常是安全的（generally recognized assafe）”。通过利用溶胶-凝胶化学原理结合不同的结构导向剂，可制备具有不同结构和形态的硅纳米颗粒（SiNPs），主要包括介孔二氧化硅纳米颗粒（MSNs）、树枝状二氧化硅纳米颗粒、空心二氧化硅纳米颗粒（HSNs）和固体二氧化硅纳米颗粒（图6）。
图6 用于蛋白质递送的二氧化硅纳米颗粒
金属纳米颗粒主要包括金纳米颗粒（AuNPs）、磁性纳米颗粒（MNPs）以及金属有机骨架纳米颗粒（MOFs），具有尺寸小、形态稳定的优点。此外，其固有的一些理化性质也使之成为癌症光声和光热治疗的理想材料。
3. 碳基纳米材料
碳基纳米材料在能源储存、生物医学等领域表现出明显优势，其基础研究和应用问题是化学、材料学研究中的一大热点。根据结构的不同，碳基纳米材料可大致分为碳纳米管（CNTs）、纳米金刚石（NDs）、富勒烯、碳点以及碳纳米球（CNs）这几种类型。
Boyer等人于2016年报道了一种非共价负载核纤层蛋白B1（LB1）的单壁碳纳米管（SWCNTs），在这一递送系统中，LB1包含的核定位序列能够促进SWCNTs定位于细胞核；此外，利用共焦拉曼和荧光成像显微镜，可以精确测定并直观显示出SWCNTs在胞内的摄取过程（图7）。
图7 负载核纤层蛋白B1的单壁碳纳米管被Hela细胞摄取
4. 细胞穿透肽
除用于修饰纳米颗粒或聚合物外，细胞穿透肽（CPPs）本身也可作为蛋白质的递送载体。CPPs能够有效将蛋白质递送至宿主细胞，然而，被细胞摄取后难以从内体中释放成为递送过程中的主要难题。有鉴于此，Akishiba团队于2017年报道了一种具有较强解膜活性的阳离子两亲性肽段（L17E）用于溶解内体膜。此外，L17E还能够有效提升外泌体介导的蛋白质胞内递送效率（图8 a,b）。
图8 L17E增强外泌体介导的蛋白质胞内递送
基于蛋白质的纳米颗粒
蛋白质纳米颗粒具有高度的特异性和修饰灵活性，可向细胞特异性地靶向递送蛋白质。目前，已有多种从动、植物中提取的蛋白质用于构建蛋白质纳米颗粒，包括胶原蛋白、白蛋白、酪蛋白、大豆蛋白等。
1. 蛋白质笼
蛋白质笼（protein cages）纳米颗粒的直径通常小于30nm，大多数蛋白质药物通过共价生物结合或基因融合而定位于笼表面。韩国蔚山国立科学技术研究院的Kang及其同事采用基因方法将可结晶片段（Fc）结合肽段（FcBP）引入铁蛋白笼，在这一系统中，人和兔的IgG抗体均能够与FcBP功能化的铁蛋白非共价结合，从而形成用于乳腺癌治疗的抗体纳米递送系统（图9 a-d）。
图9 非共价抗体蛋白质笼
受人乳头瘤疫苗和乙肝病毒疫苗的启发，广泛的多学科方法被应用于设计用于蛋白质胞内递送的病毒样颗粒（VLPs）。其中，蛋白质药物能够被负载于VLPs的表面或者内部，进而被细胞有效内化。
在众多蛋白质纳米载体（protein-basednanocarriers）中，天然纤维蛋白丝素蛋白（silk fibroin）的负载能力较高，且能够实现对药物的可控释放。然而，其超负电荷在一定程度上限制了这一载体的应用。针对这一问题，在其表面涂覆阳离子脂质层可作为一种有效的解决方案。
外泌体
外泌体（exosomes）是细胞主动向外界环境分泌的纳米囊泡结构。外泌体体积小，直径通常为30-100 nm，含有蛋白质、脂质mRNA等生物活性物质。由于外泌体属于内源性载体，与外源性纳米载体相比，其免疫原性更低，能够更好地避免网状内皮系统（RES）的吞噬。图10列举了一些基于外泌体开发的药物递送系统。
图10 基于外泌体开发的药物递送系统
总结和展望
用于胞内蛋白质递送的各类纳米载体已被广泛开发，然而，目前仍然存在一些挑战：
1）需要谨慎选择纳米材料，避免体内毒性；
2）共价或非共价修饰，以及有机溶剂的应用，均可能改变蛋白质的结构；
3）需要研明载体材料在体内的代谢过程；
4）递送系统难以从内体释放也是挑战之一；
5）需要进一步证实蛋白质药物与靶点结合后的生物活性；
6）需要建立与小鼠相比更加能够反映人体情况的新模型；
7）应积极根据患者之间的个体差异实现个性化诊疗。
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编辑人：💧Transparent
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