【一起读文献】Neuron：降低Synaptogyrin-3可挽救Tau诱导的记忆障碍和突触缺失
导读:
Tau是神经退行性变的主要驱动因素之一。Tau病理是以突触丧失和神经炎症为特征，但不清楚这些病理事件是否有因果相关。近期比利时鲁汶大脑和疾病研究中心团队在Neuron上发表了题为《Lowering Synaptogyrin-3 expression rescues Tau-induced memory defects and synaptic loss in the presence of microglial activation》的文章，探讨了致病性Tau在突触前终末的作用。发现敲除Synaptogyrin-3的杂合子小鼠能强有力地挽救由突变Tau诱导的长期突触可塑性和工作记忆方面的缺陷和突触丢失。
1. Synaptogyrin-3基因敲除小鼠可存活，并且不显示强表型
本实验使用CRISPR-Cas9技术产生了Synaptogyrin-3敲除小鼠品系(图S1A)，该小鼠存活且可育。图S1可见：在突触结合蛋白3-/-小鼠脑匀浆中未检测到突触结合蛋白-3，在突触结合蛋白3+/-小鼠中表达水平降低了一半；对其余突触结合蛋白无影响。synaptogyrin-3 +/-和synaptogygy-3 -/-都没有表现出明显的可见表型，在总体外观，体重，运动能力方面和寿命与野生型同窝小鼠没有区别。因此，在小鼠的整个生命周期中，Synaptogyrin-3的部分或完全丧失似乎可以很好地存活。
图S1.Synaptogyrin-3敲除小鼠的特征以及Tau和Synaptogyrin-3在阿尔茨海默病患者脑中的共同定位
2. CA3突触中富含Synaptogyrin-3和致病性Tau
作者评估了小鼠冠状脑切片中Synaptogyrin-3的免疫组织化学定位，作者发现Synaptogyrin-3在包括海马在内的多个大脑区域表达（图1A），并且在透明层Synaptogyrin-3与Synaptogyrin-1相比有很强的富集（图1B和1C）。苔藓纤维CA3突触包含较大的突触前末端，对于工作记忆至关重要，在阿尔茨海默氏病患者和小鼠模型的Tau相关病理的早期阶段就发生了改变。 在致病条件下，突触结合蛋白-3作为突触前末端的Tau受体。因此，作者评估了这两种蛋白质在表达致病性Tau的小鼠(Tau P301S)中的定位。与野生型同窝小鼠相比，作者发现6个月大的Tau P301S小鼠在透明层中有很强的Tau积累，而其他海马层的Tau水平似乎相似(图1D和1E)。作者观察到在透明层中Tau和突触前蛋白突触蛋白-3和突触蛋白的强联合标记(图1F和1G)，表明在这个阶段Tau在苔藓纤维-CA3突触中的突触前积累。作者从野生型和Tau P301S小鼠中分离出这些突触，并使用特定标记进行标记，从而验证致病性Tau定位于突触融合蛋白-3阳性苔藓纤维-CA3突触（图1H-J）。进一步证实了在6个月大的Tau P301S小鼠的苔藓纤维CA3突触的突触前末端中存在突触结合蛋白-3和致病性Tau。
接下来，作者探讨了突触定位的Tau是否与该模型中的囊泡相关。通过WB证实Tau和突触结合蛋白-3存在于从Tau P301S小鼠中纯化的突触囊泡部分，并且在野生型同窝动物明显降低(图1K)，然而这种差异不仅仅是因为Tau过表达(图1K，L)。因此在Tau P301S小鼠中，Tau与突触小泡部分的分离明显多于Tau过表达的量，这与该模型中Tau与突触小泡的关联一致。
最后，作者还测试了Tau和突触结合蛋白-3是否共同定位于阿尔茨海默病患者大脑的突触前末端。通过对五名阿尔茨海默病患者和五名年龄匹配的健康对照者的死后中/下颞皮层切片进行了阵列断层扫描并进行免疫荧光染色，结果表明，与健康对照组相比，Tau在阿尔茨海默病患者大脑的突触前末端显示出与突触融合蛋白-3的共定位增加（图S1L，M）。
图1：Synaptogyrin-3和致病性Tau在苔藓纤维-CA3突触中富集
3. Synaptogyrin-3的缺失保留了Tau P301S小鼠的突触可塑性
作者通过评估6至7个月大的Tau P301S小鼠急性海马切片中这些突触的电生理特性，评估了致病Tau对苔藓纤维-CA3突触功能的贡献(图2A)。当对苔藓纤维施加递增的单一刺激时，作者发现Tau P301S的透明层和野生型同窝对照的突触后电位是不可区分的(图S2D)，表明一般兴奋性不受影响。接下来，应用成对脉冲刺激作者发现Tau P301S小鼠和野生型对照组的反应幅度之比相似(图S2E)。这表明致病性Tau在病理学的早期阶段不影响苔藓纤维-CA3突触的短期可塑性。因此，致病性Tau不影响苔藓纤维-CA3突触的基本突触传递特征。
接下来，作者测量了长期可塑性，发现致病性Tau的表达限制了LTP的诱导和维持(图2B)。另外，通过记录了6至7个月大的Tau P301S synaptogirin-3+/-小鼠苔藓纤维CA3突触的LTP ，作者发现其反应与野生型小鼠相似，高于Tau P301S小鼠(图2B-2E)。野生型动物突触结合蛋白-3的减少对LTP反应没有影响，因为突触结合蛋白-3 +/-小鼠可与野生型的同类相媲美(图2B-2E)。因此，突触结合蛋白-3水平的降低纠正了苔藓纤维-CA3突触由致病性Tau诱导的长期可塑性缺陷。
图2：降低突触结合蛋白-3的表达可挽救Tau P301S小鼠的突触可塑性
作者还测试了降低突触结合蛋白-3的表达是否会影响其他突触的Tau诱导的缺陷，并记录了Schaffer侧枝-CA1突触的LTP(图S2F)。发现6-7月龄野生型和Tau P301S小鼠身上记录Schaffer侧枝CA1突触的LTP之间没有差异(图S2G)。由于Tau P301S小鼠中Tau的积累大部分限于CA3透明层（图1D）。但是，当在8个月大的Tau P301S小鼠中记录LTP时，即Tau积累已经扩展到CA1海马区的年龄，作者发现Schaffer侧支CA1突触的LTP严重受损。有趣的是，敲除突触融合蛋白-3（Tau P301S；突触融合蛋白3 +/-小鼠）的表达可以挽救这一缺陷（图S2H–S2K）。这些发现表明，降低突触素-3水平的积极作用不仅限于具有强突触前成分的突触，而且对其他突触也适用。
图S2:Tau P301S；突触素3 +/-小鼠的生成和苔藓纤维CA3和Schaffer侧支CA1突触的电生理数据
4. Synaptogyrin-3的缺失恢复了Tau P301S小鼠的工作记忆缺陷
长期突触可塑性是学习和记忆机制的基础。 作者在两种不同版本的莫里斯水迷宫（MWM）测试中评估了Tau P301S和野生型小鼠的学习和记忆力。 在6-7个月大的小鼠中，Schaffer侧枝CA1的LTP尚未受到影响(图S2G)，在Tau P301S小鼠和同窝对照之间的空间参考记忆测试中没有发现显著差异(图S3A-S3C)。然而，在工作记忆测试中，6至7个月大的Tau P301S小鼠的表现比野生型小鼠差：它们未能显著减少连续游泳寻找平台所需的路径长度(图S3D)。这些结果与在此阶段Tau P301小鼠的苔藓纤维-CA3突触的LTP受损相符（图2）。作者验证了工作记忆中的缺陷不受性别影响（图S3E）。还验证了Tau P301S小鼠的工作记忆缺陷不是发育起源的，因为3到4个月大的Tau P301S小鼠在连续游泳时确实可以改善其表现（图S3F）。
图3：synaptogyrin-3表达的降低恢复了Tau P301S小鼠的工作记忆缺陷
鉴于突触融合蛋白-3的减少纠正了苔藓纤维CA3突触LTP的病原性Tau诱导的缺陷，作者接下来探讨这是否也纠正了6至7个月大的Tau P301S小鼠的工作记忆缺陷。Tau P301S; synaptogyrin-3 +/-小鼠的表现与野生型小鼠相同，并且它们在适应新的空间位置方面比Tau P301S小鼠更有效，这在统计学上显着减少了寻找新的位置所需的路径长度和时间（潜伏期）。因此，工作记忆缺陷是由突触前致病性Tau直接诱导的，并且取决于突触前蛋白Synaptogyrin-3的存在。
图S3：来自空间参考记忆和工作记忆测试的行为数据
5.降低Synaptogyrin-3水平可防止Tau P301S小鼠的突触丢失
患有Tau病的患者和表达致病性Tau的小鼠的共同特征是突触的丧失，尤其是在海马体中。作者用免疫组织化学方法评估了Tau P301S小鼠苔藓纤维-CA3突触所占的总面积。发现与野生型小鼠相比，Tau P301S小鼠的所有突触标记物都减少了(图4A和4A)。然而P301S；synaptogirin-3 +/-小鼠的突触层、透明层区类似于野生型的同窝动物(图4B和4B)，这与蛋白质印记的结果一致(图S4C和S4D)。总之，这些数据表明突变Tau诱导的突触丢失是通过降低突触结合蛋白-3的表达来挽救的。同时通过透射电子显微镜观察：与野生型同窝仔相比，在Tau P301S小鼠中发现较少的释放位点，并且观察到这种缺陷在Tau P301S；synaptogyrin-3 +/-小鼠中得以挽救（图S4G）。得出结论，在表达致病性Tau的动物中降低Synaptogyrin-3的水平可以保持突触的完整性。
图4：在Tau P301S小鼠中减少synaptogyrin-3可以防止与神经胶质细胞增殖和激活无关的突触丢失
6. Tau诱导的星形胶质细胞和小胶质细胞的激活不依赖于Synaptogyrin-3
小鼠中致病性Tau的表达诱导了小胶质细胞和星形胶质细胞的非细胞自主激活。但是尚不清楚致病性Tau是如何触发神经胶质细胞活化的，以及这种活化是否确实对突触丧失至关重要。通过免疫荧光作者发现8到9个月大的Tau P301S小鼠在透明层中显示出星形胶质细胞和小胶质细胞总数的重要增加（图4F-4I）。有趣的是与对照组相比，Tau P301S；synaptogyrin-3 +/-小鼠在星形胶质细胞和小胶质细胞中显示出相似的增加（图4F-4I）。尽管可以挽救这些动物的突触变性（图4A-4E）。作者分析了GFAP阳性和Iba1阳性细胞的形态，发现它们大多数都存在于P301S和Tau P301S中。synaptogyrin-3 +/-小鼠具有丰富的浓厚过程，这是典型的反应性星形胶质细胞和活化的小胶质细胞（图4F和4H）。qRT-PCR测量了海马中DAM基因的表达证实了在表达Tau P301S的小鼠中小胶质细胞激活水平增加，但在相同程度上，在Tau P301S；synaptogyrin-3 +/-小鼠中也是如此（图4J）。在Tau P301S和Tau P301S；synaptogyrin-3 +/-小鼠中，小胶质细胞体内稳态基因的表达也增加了（尽管少于DAM基因）。（图S4H）。这些数据表明Tau诱导的突触变性和神经炎症可以解除，突触可以在神经炎症反应的早期保留。
图S4：突触丢失和小胶质细胞激活的扩展分析
结 论
该研究通过降低突触囊泡相关蛋白synaptogyrin-3的水平来干扰致病性Tau的突触前特异性功能。结果发现降低synaptogyrin-3的表达可以保护表达致病性tau的神经元免受突触可塑性缺陷、突触丢失和工作记忆下降的影响，表明突触前Tau病理介导了所有这些缺陷。
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Pablo Largo-Barrientos , Nuno Apo ´stolo , Eline Creemers , ... ,Joris de Wit, Valerie Uytterhoeven , Patrik Verstreken , Lowering Synaptogyrin-3 expression rescues Tau-induced memory defects and synaptic loss in the presence of microglial activation.Neuron. March 3,2021.doi:10.1016/j. neuron.2020.12.016.END
校 审 / 梁 春 梅
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