【一起读文献】Molecular Psychiatry：小胶质细胞来源LAG3参与应激引起的抑郁样行为

导读：

     尽管有证据表明小胶质细胞与重度抑郁症的病因学和病理生理学有关，但小胶质细胞在抑郁症中的作用是复杂的，一些研究表明抑郁症与小胶质细胞激活有关，而另一些研究表明抑郁症与小胶质细胞的减少和退化有关。同样，包括抗抑郁药物和电休克治疗在内的抗抑郁治疗的作用机制也没有完全被阐明。近期一篇发表在《Molecular Psychiatry》（IF=15.992）的文章“Microglia and their LAG3 checkpoint underlie the antidepressant and neurogenesis-enhancing effects of electroconvulsive stimulation”，发现静息态小胶质细胞并不参与应激引起的抑郁发生过程，但小胶质细胞来源的免疫基因LAG3参与应激引起的抑郁样行为。对正常饲料组抑郁小鼠进行电休克刺激后Lag3表达降低最为明显，且在降低正常饲料组抑郁小鼠Lag3水平后也能够发挥快速抗抑郁作用。这些发现提示脑小胶质细胞来源的LAG3可能是新型抗抑郁治疗的一个有前景的靶点。

1. 小胶质细胞缺失不会引起抑郁样症状或其他行为症状

        环境、药理学和调节小胶质细胞动力的遗传因素，已被证明可以影响压力应对情绪和调节心境。然而，小胶质细胞在正常静息状态下维持情绪和心境的作用尚未被直接探讨。本实验中，作者采用非侵入性药物治疗，通过饮食中含有集落刺激因子(CSF)-1受体拮抗剂PLX5622 (PLX)诱导全脑小胶质细胞衰竭。3周后，与对照组饮食(CDiet)相比，PLX饮食的小鼠在海马和大脑所有其他区域的小胶质细胞数量显著减少。尽管小胶质细胞减少，但两组小鼠在体重、蔗糖偏好、社会探索(SE;图1e)，空间海马依赖记忆功能，焦虑水平(在高架+迷宫张开双臂的时间)，和高架+迷宫的运动活动均无差异（图1）。

图1 小胶质细胞缺失对体重和行为的影响

2. 小胶质细胞的缺失或抑制会破坏ECS的抗抑郁和促进神经生成的作用

        此前有报道称ECS会影响小胶质细胞的形态和激活状态，因此作者研究了小胶质细胞在抑郁样行为发展中的作用以及电休克治疗（ECS）对抑郁样行为的逆转 (图2a)。与第一个实验的结果相似，非应激PLX处理组与非应激CDiet行为学无明显差异 (图2b,d,f)，表明全脑小胶质细胞耗竭(即使连续耗竭超过9周)并不会诱发类似抑郁的行为。在CUS暴露后，CDiet组和PLX组小鼠的蔗糖偏好和探索实验均出现了类似的降低(图2b,d)。

      小胶质细胞的缺失显著削弱了ECS的抗抑郁作用。尽管ECS增加了所有CUS暴露组小鼠的蔗糖偏好，但与PLX处理组相比，CDiet组(其中ECS将蔗糖偏好恢复到通常在非应激小鼠中观察到的正常水平)的这种增加明显更大(图2c)。在探索实验中也观察到类似的结果，但没有达到统计学意义(图2e)。在强迫游泳中，单独使用PLX没有效果，这表明小胶质细胞的缺乏并不会导致抑郁；ECS治疗后，PLX处理组不动时间明显长于CDiet治疗组(图2f)，证实了小胶质细胞参与了ECS的抗抑郁机制。海马神经发生的免疫组化分析显示，小胶质细胞和双皮质素(DCX)标记的新生神经元并置，提示它们相互作用。CUS暴露的CDiet处理小鼠经ECS治疗后，齿状回DCX标记的新生神经元数量(与SHAM处理的小鼠相比)显著提高了，且可达到非应激小鼠的水平(图2g - i)。在CUS暴露的PLX处理组小鼠经ECS治疗后产生了相反的效果，(与SHAM处理的小鼠相比)DCX标记的齿状回新生神经元的数量明显减少了(图2g, j, k)。

图2 小胶质细胞参与 ECS 的抗抑郁和神经发生增强作用

       为进一步研究小胶质细胞在ECS治疗中的作用，作者检测了可抑制小胶质细胞活化药物—米诺环素(minocycline, MINO)对ECS抗抑郁和促进神经生成作用的影响。CUS暴露开始5周后，小鼠接受SHAM刺激或ECS治疗2.5周，同时持续给予MINO(通过饮用水)或仅用水(WAT)(图2l)。与非应激对照组相比，CUS-WAT-SHAM组小鼠的蔗糖偏好显著降低，而CUS-WAT-ECS组小鼠则相反(图2m)。在饮用MINO的小鼠中，ECS并无法改善糖水偏好的降低。在FST中，ECS降低了CUS-WAT和CUS-MINO组小鼠的静止时间(Fig.2n)。虽然这种降低在饮MINO的小鼠中稍小，但ECS治疗所致的CUS-WAT-ESC和CUS-MINO-ESC组不动时间的差异没有统计学意义。单独使用MINO对蔗糖偏好和强迫游泳无影响;这一发现是意料之中的，因为之前的研究发现MINO具有抗抑郁作用，可能是因为受试者中包含小胶质细胞激活者。而当前的实验是基于与小胶质细胞抑制相关的抑郁模型，MINO不能影响小胶质细胞已经下降的状态，进而逆转了ECS所致的小胶质细胞状态的改变。通过计数治疗终止后DCX阳性细胞来评估齿状回(DG)的神经发生情况， CUS显著降低了饮WAT或MINO饮用SHAM组的神经发生水平(与对照组、非应激小鼠相比)。在CUS-WAT组中，ECS逆转了CUS的有害影响，将神经新生水平提高到非应激对照组的水平。相比之下，在CUS-MINO组中，ECS对神经发生的有益作用被完全阻断，证实了小胶质细胞激活在ECS诱导的促进神经发生中的关键作用(Fig.2o)。

3. 小胶质细胞的缺失阻断了ECS诱导的分子改变

       为了阐明在ECS在PLX处理的小鼠中抗抑郁效果减弱的潜在分子机制，作者对海马区参与情绪调节和认知过程以及介导ECT治疗效果的基因表达进行检测。RNA测序(RNA- seq)分析显示，在暴露于CUS的小鼠中 PLX处理对海马基因表达有显著影响，这可能是小胶质细胞耗竭的后果。在SHAME处理的小鼠中，共有390个基因在CUS-PLX和CUS-CDiet处理的小鼠中有差异表达，其中338个基因表达下调，52个基因表达上调(q< 0.32，截断值为±1.3倍)。在ECS处理的小鼠中，共有497个基因在CUS-PLX和CUS-CDiet处理的小鼠中存在差异，其中384个基因表达下调，113个基因表达上调(q< 0.32，截断值为±1.3倍)(见GEO Series accession number GSE123027)。RNA-Seq分析还发现，ECS显著调控了多个海马基因的表达。在CDiet小鼠中，共15个基因在CUS- SHAM与CUS-ECS小鼠之间存在差异表达，其中9个基因表达下调，6个基因表达上调(图3a; q< 0.32，截断值为±1.3倍)。6个下调的基因影响免疫过程，其中一半的基因是免疫检查点，包括淋巴细胞激活基因3 (Lag3）、分化簇180 (Cd180，也称为Rp105）和色氨酸-2,3-双氧合酶(Tdo2）。ECS也降低了另外两个免疫点簇分化86 (cluster of differentiation 86，也称B7 -2）和程序性死亡配体1 (programmed death-ligand 1, Pd-L1）的表达，但其显著性水平未达到校正。ECS上调表达的基因包括对神经发生至关重要的Sox11，以及介导多巴胺能神经传递的多巴胺受体D1 (Drd1）和突触囊糖蛋白2C。然而在PLX处理组中，CUS-SHAM和CUS-ECS小鼠之间没有差异表达的基因。

       为了验证RNA-Seq数据，作者进行了实时定量PCR实验，评估CUS小鼠海马中被PLX或ECS明显改变的基因(图3)。与RNA-Seq分析结果一致， PLX处理的小鼠无论经ECS处理与否，小胶质细胞基因如Iba1和P2ry12的转录本均显著下降(图3b,c)。在RNA-Seq分析中，只有两个基因的表达被PLX饲料显著降低，即Lag3和Cd180（图3a），也同时被ECS降低。qPCR结果证实Lag3在CUS-CDiet-ESC中比与CUS-CDiet-SHAME的小鼠减少的更显著(图3d)。Cd180的表达也有类似趋势，但未达到统计学意义(图3e)。作者还验证了RNA-Seq分析结果提示不受小胶质细胞衰竭但在CDiet处理的小鼠中被ECS显著改变 (Tdo2, Pla2g4e, Sox11，和Drd1(图3f - i))的四种基因转录本。qPCR分析验证, Tdo2和Pla2g4e在CUS-CDiet-ESC组显著下调，但在PLX处理组中没有差异。在CDiet组中，ECS显著提高了与成人神经发生相关的基因Sox11和多巴胺受体1 (Drd1)基因的表达水平，后者也与神经发生相关，并调节脑源性神经营养因子的产生而在PLX处理组两者均无差异。

图3 ECS诱导的分子改变在小胶质细胞缺失的小鼠中消失

4. ECS调节小胶质细胞密度形态和LAG3表达

        先前研究表明暴露于此处使用的特定CUS刺激可以减少海马DG区中小胶质细胞的数量并改变其形态，但对其他脑区影响较小。DG内的小胶质细胞具有成人海马神经发生特性。为了阐明该模型中ECS对小胶质细胞的影响，对CUS刺激5周后又进行2.5周ECS或SHAM治疗的小鼠DG区小胶质细胞的形态学变化分析。与非应激对照组相比，CUS- SHAM组小鼠的DG区小胶质细胞密度显著降低;但ECS逆转了这一趋势(图4a)。与非应激对照组和CUS- SHAM组相比，CUS- ECS组小胶质细胞iba1阳性胞体的大小显著增加(图4b)。与非应激对照组相比，CUS- SHAM组小鼠DG小胶质细胞的总面积(包括突起区)显著减少，但ECS可逆转这种减少(图4c)。最后，与非应激对照组相比，暴露CUS小鼠的DG区小胶质细胞iba1免疫染色过程的总长度显著减少(图4d)， 且ECS对该参数无影响。总体而言，ECS诱导的逆转小胶质细胞数量和细胞总面积的下降代表了小胶质细胞激活状态的正常化，而胞体面积的增加和突起长度的减少表明了轻度激活状态(图4e-g)。          Lag3属于免疫球蛋白(Ig)超家族，可被包括脑小胶质细胞在内的许多免疫细胞表达。Lag3包含一个MHC-II相互作用域和一个KIEELE 模体，可负性调控T细胞的扩张和稳态。目前对大脑中小胶质细胞LAG3的抑制性免疫检查点活动知之甚少。RNA-Seq分析显示，在PLX处理的小鼠中，Lag3的表达显著减少。在RNA-Seq和qPCR分析中，Lag3是被ECS显著减少的小胶质细胞基因(图3a, d)。IBA-1和Lag3抗体免疫组化染色显示，小胶质细胞强烈表达Lag3蛋白，所有iba -1标记的小胶质细胞均与Lag3共标记，并观察到Lag3染色与血管相关(图4h-j)。在PLX处理的小鼠中，剩余的小胶质细胞表达较少的Lag3 (尽管血管相关细胞的表达保持完整) (图4k-m) ，这与分子分析的结果一致(图3a, d)。单个细胞的检测显示，Lag3在小胶质细胞的胞体和突起上表达(图4n- p)。在人类额叶皮质切片中，P2Y12标记的小胶质细胞也表达Lag3 (图4q-s)。

        对小胶质细胞Lag3染色强度(在胞体和突触)进行测量，与对照组相比，CUS- SHAM组小鼠小胶质细胞Lag3染色强度显著升高(Fig.4t, u，v)。这种小胶质细胞检查点分子的升高可能是CUS诱导的小胶质细胞下降的原因，这与过往的研究一致。ECS降低了小胶质细胞中Lag3蛋白的强度(图4t, v, w)，与ECS对Lag3 mRNA的影响一致(图3a,d)。这种减少证实了ECS对小胶质细胞数量和形态的影响，提示ECS诱导的Lag3检查点的减少有助于小胶质细胞的形态改变。

图4 ECS对小胶质细胞数量、形态和Lag表达的影响

5. 特异性抗LAG3抗体阻断小胶质细胞的LAG3检查点，可诱导抗抑郁作用和增强神经发生

       LAG3在大脑中的信号通路尚不清楚，其可能是一种已建立的传递抑制信号来控制大脑免疫细胞稳态的免疫检查点受体。LAG3的特异性抗体已被证明可以作为免疫检查点阻断剂，刺激周围免疫并产生抗肿瘤耐药性。与其他免疫细胞类似，小胶质细胞的反应也受到各种检查点分子的紧密调控。用特异性的抗LAG3单克隆抗体(mAb)抑制LAG3小胶质细胞检查点来确定其是否可以诱导ECS样的抗抑郁作用和促进神经发生。CUS暴露5周后，小鼠急性注射抗lag3单抗或同型IgG对照抗体。分别在第3天和第5天评估蔗糖偏好和强迫游泳不动时间(图5a)。CUS-IgG组小鼠在注射前后对蔗糖的偏好无差异。CUS- LAG组小鼠显示出LAG3的特异性抗体的注射逆转CUS诱导的蔗糖偏好的降低(图5b)。在治疗后5天的强迫游泳试验中，CUS-IgG小鼠的不动时间显著高于CON-IgG小鼠。这种CUS对FST绝望的影响通过抗LAG3 mAb治疗得以缓解(图5c)。这些发现表明抗LAG3治疗可以作为一种快速的抗抑郁治疗方法。小胶质细胞形态的进行分析，虽然LAG mAb治疗对小胶质细胞的总大小没有影响(Fig.5d)，但它完全逆转了CUS诱导的小胶质细胞突起数量减少(Fig.5e)，对突起长度也有类似但不显著的影响(Fig.5f)。CUS暴露显著增加了小胶质细胞LAG3染色强度。与ECS相比，使用LAG3 mAb处理后显著提高了LAG3的表达(图5g)。

图5a-g 急性给药LAG3单抗对CUS暴露小鼠抑郁样症状的影响

        为了进一步证明LAG3单抗慢性方案的抗抑郁效果，并与SSRI药物艾司西酞普兰(ESC, Cipralex®)的效果进行比较，作者进行了额外的实验。在暴露CUS 5周后，验证了蔗糖偏好和社会探索减少方面的快感缺乏后，小鼠被长期注射抗LAG3抗或同型IgG抗体(图5h)。在3周内，每4天注射一次，共6次。每组再分为两个亚组，每天注射ESC 或生理盐水。一组非应激小鼠作为CUS一般效应的对照组。与处理前水平相比，抗LAG3 mAb处理后的蔗糖偏好显著提高，而有IgG抗体处理或ESC处理均无此效果(图5i)。分别抗LAG3-SAL和IgG-ESC治疗后，社会探索水平显著升高。相反，LAG3-ESC对社会探索无影响(图5j)。在强迫游泳中，抗LAG治疗可逆转有CUS诱导的不动时间增加的趋势，但未达到统计学意义(图5k)。对小胶质细胞形态进行分析，在SAL组中，抗LAG3 mAb治疗逆转了CUS诱导的总细胞面积减少，但在ESC组中抗LAG3 mAb治疗却没有此现象(图5l)。与无应激对照组相比， SAL组经IgG和抗LAG处理的小鼠的突触数均减少(图5m)。与对照组小鼠相比，CUS-IgG-SAL和CUS-IgG-ESC小鼠的突触长度显著缩短，而CUS-抗LAG3-SAL小鼠可挽救这种缩短，但CUS-抗LAG3-ESC小鼠不行(图5n)。CUS诱导的海马DG新生(dcx阳性)神经元数量的减少可被LAG3单抗治疗(其诱导的神经发生水平甚至比对照组更高)以及较小剂量ESC治疗逆转，而同时使用抗LAG3 mAb和ESC两种药物治疗的组则没有这种改善(图5o)，这符合两种药物在行为和小胶质细胞作用方面的负相互作用。

       为了检验抗LAG3 mAb是否能通过抑制小胶质细胞检查点直接影响小胶质细胞，用抗LAG3 mAb对小鼠BV-2小胶质细胞进行预处理，然后将其暴露于免疫刺激因子Poly I :C 24小时。暴露于1µg/ml Poly I:C导致细胞介质中细胞因子TNF α水平显著升高(F_5,14=214.5,p< 0.001)。用LAG3抗体预孵育细胞，TNFα细胞因子水平呈浓度依赖性升高，20µg/ml (p< 0.01相比Poly I:C组)至50µg/ml (p< 0.001)逐渐升高TNF-α水平(图5p)。

图5h-t 慢性给药LAG3单抗对CUS暴露小鼠抑郁样症状的影响

        抗LAG3 mAb是外周注射的，为验证抗体是否进入大脑，使用了急性(图5q)或慢性(图5r)注射抗LAG3单抗的小鼠脑组织切片。除血管染色外，抗LAG3阳性染色存在于脑实质，这表明抗体从周围转移到中枢神经系统。同时抗LAG3抗体和抗iba1抗体染色。在急性(图5s)或慢性(图5t)治疗条件下，小胶质细胞附近均可见抗LAG3染色。

4. ECS调节小胶质细胞密度、形态和LAG3表达

       本文发现清除大脑小胶质细胞后并不会诱导小鼠抑郁样行为，也并不会阻止慢性应激引起的抑郁样行为。电休克可通过调节小胶质细胞LAG3的来实现抗抑郁治疗，当小胶质细胞被清除后，电休克的抗抑郁作用也消失了。注射抗LAG3 mAb也可达到抗抑郁作用，但当同时注射西酞普兰后抗抑郁作用减弱了。小胶质细胞衰退和退化的情况下，抗抑郁治疗应通过刺激小胶质细胞达到其稳态激活水平，从而使小胶质细胞恢复与这些情况相关的神经行为异常(图6)。

精读文献请下载原文：

Rimmerman N, Verdiger H, Goldenberg H, Naggan L, Robinson E, Kozela E, Gelb S, Reshef R, Ryan KM, Ayoun L, Refaeli R, Ashkenazi E, Schottlender N, Ben Hemo-Cohen L, Pienica C, Aharonian M, Dinur E, Lazar K, McLoughlin DM, Zvi AB, Yirmiya R. Microglia and their LAG3 checkpoint underlie the antidepressant and neurogenesis-enhancing effects of electroconvulsive stimulation. Mol Psychiatry. 2021 Oct 14. doi: 10.1038/s41380-021-01338-0.

END

编 译 / 张丹丹

校 审 / 蔡玉洁

小崔和他的小伙伴们