封面文章：抑制早期细菌生物膜的四面体框架核酸递送系统

研究背景

 由于病原菌的抗药性急剧增加，对人类健康构成了重大威胁。特别地，形成生物膜的细菌对细菌的抵抗力是浮游细胞的500到5000倍，这也是造成慢性感染的主要机制，慢性感染占人类传染病的60-80％。最近，纳米材料作为可用于对抗致命细菌感染的新工具而出现。我们基于核酸纳米材料的特性和细菌生物膜自身的形成机制，提供了一种干预细菌生物膜早期新形成的新策略，以克服传统抗菌剂面临的障碍。

Multi‑targeted Antisense Oligonucleotide Delivery by a Framework Nucleic Acid for Inhibiting Biofilm Formation and VirulenceYuxin Zhang, Xueping Xie, Wenjuan Ma, Yuxi Zhan, Chenchen Mao, Xiaoru Shao, Yunfeng Lin* Nano-Micro Lett.(2020)12:74https://doi.org/10.1007/s40820-020-0409-3

本文亮点

 1 自组装形成的框架核酸载体系统在保持框架核酸自身性质的同时，携带了具有多重靶向性的反义寡核苷酸复合序列。2 通过模拟变异链球菌生物膜中VicRK信号转导系统的作用机制，设计出了具有多重靶向性的反义寡核苷酸复合序列，赋予了框架核酸载体系统的多重靶向性。3 首次提出将框架核酸载体系统应用于细菌生物膜，并能够高效性的干预细菌生物膜的早期形成。

内容简介

四川大学华西口腔医学院林云锋团队长期致力于研究框架核酸纳米材料在治疗重大疾病中的应用，通过模拟VicRK信号转导系统的作用机制设计出了具有多重靶向性的反义寡核苷酸复合序列，并开发了顶点型的tFNA递送系统递送靶向多种基因的反义寡核苷酸，它可以轻松的进入细菌细胞并发挥功能。这种基于VicK蛋白结合位点的保守区域设计的具有多个靶标的反义寡核苷酸序列，一旦被tFNA输送到细菌细胞内，它们会显着降低胞外多糖(EPS)合成和生物膜厚度。与现有方法相比，该系统非常有效，能同时减少了所有目标基因(gtfBCD，gbpB，ftf)的表达。证明了一种具有多靶点抑制作用的新型核酸纳米载体系统(ASOs-tFNA)，具有治疗生物膜引起的慢性感染的巨大潜力。

图文导读

Ⅰ 多重靶向的框架核酸载体系统的表征

将具有功能性的的反义寡核苷酸混合序列通过磷酸二酯键与tFNA的S2链5’相连。与单纯的tFNA合成方式一样，通过控制温度而进行自组装，形成带有手臂链的四面体结构，文中分别使用PAGE，DLS，AFM等手段检测了ASOs-tFNA的理化性质。特别地，从AFM图像中可以明显看到四面体顶点延伸出的手臂链。证实了该反义寡核苷酸递送系统地成功构建。

图1. (a)ASOs-tFNA的电泳图；(b，d)tFNA和ASOs-tFNA的DLS分析；(c)ASOs-tFNA的合成示意图，(e)tFNA和ASOs-tFNA的AFM图，(f)tFNA和ASOs-tFNA的DLS和ZETA电位的数据分析。

Ⅱ ASOs-tFNAs在浮游性变异链球菌中的摄取率和对生长的影响

为了使ASOs-tFNA对细菌生物膜形成和毒力产生的任何影响，首先必须确定变形链球菌对ASOs-tFNA的摄取。用流式细胞仪测定在不同浓度(500或750 nM)的Cy5标记的tFNA，ASO和ASOs-tFNA孵育的变形链球菌在12小时内的摄取率。ASOs-tFNA载体系统靶向的基因gtfBCD，gbpB和ftf，不会在浮游的变异链球菌中表达。因此，预计在无蔗糖的BHI培养基中(浮游细菌培养)不会影响变形链球菌的生长性能。

图2. (a)不同浓度的单链ASOs, tFNAs和ASOs-tFNAs被浮游细菌的摄取情况；(b)不同浓度的tFNA和ASOs-tFNA对浮游细菌的生长影响。

Ⅲ ASOs-tFNAs对变异链球菌生物膜形成的抑制作用

ASOs-tFNA对生物膜形成的抑制是否依赖于抑制胞外多糖的合成，文章通过CLSM评估了生物膜生长和EPS积累的程度。下图给出了细菌细胞(绿色)和EPS(红色)的代表性三维图像，显示了生物膜的形态。使用共聚焦成像数据集在COMSTAT软件处理后量化了从培养皿表面到液体界面的细菌和EPS的垂直分布。

图3. (a，b)不同浓度的tFNA，ASOs及ASOs-tFNA处理BF的3D重建图像和数据分析。

Ⅳ ASOs-tFNAs对EPS形成及目标基因表达的抑制作用

文中通过SEM图像进一步证实了ASOs-tFNA对生物膜形成的影响。用750 nM ASOs-tFNAs处理后的生物膜显示胞外多糖显着降低，图中疏松且多孔的海绵状物质即为胞外多糖(白色箭头)。此外，变形链球菌未显示形态异常，例如细胞壁受损或肿胀，表明ASOs-tFNAs没有明显的杀菌作用，侧面说明，ASOs-tFNAs是通过抑制胞外多糖形成而破坏生物膜形成，不是通过杀菌作用。

图4. (a)tFNA，ASOs及ASOs-tFNA处理后的细菌生物膜的SEM图像。(b)ASOs-tFNA处理后，目标基因的表达情况。

作者简介

张雨欣（本文第一作者）

四川大学华西口腔医学院 硕士

▍主要研究领域

核酸纳米载药系统的构建，及其在微生物领域的应用。▍Email: [e-mail]林云锋（本文通讯作者）四川大学华西口腔医学院

教授 博士生导师

▍主要研究领域

核酸纳米材料在组织再生，基因传递，药物运输等方面的应用及临床转化研究。

▍主要研究成果

第十三届中国青年科技奖获得者，中组部国家“万人计划”领军人才，科技部中青年科技创新领军人才，教育部新世纪优秀人才，天府万人计划领军人才，四川省杰出青年。发表通讯作者SCI论著120余篇，被引用4600余次，主编英文专著7部。获得中华医学科技奖、华夏医学科技奖、教育部科技进步奖、全国百篇优秀博士论文、亚太青年科学家奖、Scopus未来科学之星、霍英东青年教师奖等荣誉。▍Email: [e-mail]

撰稿：原文作者

编辑：《纳微快报》编辑部

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