非编码RNA真的不编码吗？9张图告诉你答案
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近期，Molecular Cell和Cell Research刊登了三篇有关环状RNA具有翻译能力的研究，可谓一石激起千层浪，打破了传统的环状RNA是非编码RNA的概念，进一步拓展了环状RNA的功能，丰富了蛋白质组的组成，意义重大。由此，我们不禁要问，其他的非编码RNA，特别是长非编码RNA，拥有与mRNA类似的结构和小的开放阅读框，是否也具有编码的能力呢？有趣的是，虽然长非编码RNA一经鉴定出来就被定义为非编码RNA，但是关于它们编码潜能的探索，却没有停止。
小编将通过9幅图，给大家梳理环状RNA和长非编码RNA翻译能力的研究进展。需要注意的是，虽然已有个别非编码RNA被实验证明可以翻译出小肽，有大量非编码RNA被生物信息学预测可以翻译出小肽，但也有研究发现，绝大部分非编码RNA即使结合在核糖体上，也仍然是不翻译的。这两个阵营的研究都在9幅图里，希望帮大家快速了解有关非编码RNA的编码研究。
中国科学院王泽峰研究员在Cell Research上发表题为《Extensive translation of circular RNAs driven by N6-methyladenosine》的研究论文，发现环状RNA上的甲基化修饰m6A可以驱动非帽依赖性的翻译机制来合成蛋白质。RNA m6A修饰是近年来RNA表观遗传学的研究热点，越来越多的研究发现m6A与胚胎发育和疾病，特别是肿瘤，都密切相关。RNA m6A的研究多集中在mRNA上，可影响mRNA的翻译效率和稳定性，而环状RNA上的m6A修饰，此前尚属空白。王泽峰研究员此前已发现在环状RNA上插入IRES（核糖体进入位点）序列可促进环状RNA的翻译，然而在对照序列样品中，竟然也发现有蛋白的翻译。通过对这个看似矛盾的现象进行仔细的分析，研究人员发现所有的对照序列竟然都包含m6A修饰位点，这提示m6A修饰可促进环状RNA的翻译（图1）。
研究人员通过分析MeRIP-seq数据，证明內源环状RNA确实含有m6A修饰，并利用IP，RIP和CLIP-seq等技术，发现m6A的阅读蛋白YTHDF3可与翻译起始因子eIF4G2高结合，促进翻译（图2）。
以上实验证明在体外构建含m6A修饰的环状RNA，导入细胞后可以翻译，那么内源的含m6A修饰的环状RNA是否可以翻译呢？遗憾的是，研究人员在对蛋白质组的质谱进行分析后，并未找到符合他们预测的环状RNA编码的肽段。
如果说找到内源可翻译的环状RNA是为它摘掉“非编码”帽子的铁证，那么接下来这两篇Molecular Cell的文章可以说大大减少了上篇文章的遗憾。
意大利科学家Irene Bozzoni发表《Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis》的研究，证明在肌肉发育过程中发挥关键作用的环状RNA Circ-ZNF609，可翻译小肽。
研究者首先通过RNA测序技术，在人和老鼠的肌肉发育模型中鉴定到一系列差异表达的环状RNA，通过大规模的功能筛选，最终确定circ-ZNF609在肌肉发育中扮演重要角色。在探究circ-ZNF609促进肌肉发育的分子机制时，研究人员惊喜的发现circ-ZNF609具有开放阅读框，暗示其具有编码蛋白的能力。将体外构建的含FLAG标签的环状RNA载体导入细胞后，通过western blot的检测，可以看到在目的位置有明显的条带，说明人工构建的带FLAG标签的circ-ZNF609是可以翻译的（图3）。
那么，内源的circ-ZNF609同样可以翻译吗？为了解决这个问题，研究者利用CRISPR技术，将FLAG标签敲入circ-ZNF609的编码区域以检测内源蛋白的表达。由于筛选到的单克隆细胞只成功地在一个circ-ZNF609基因座位插入了FLAG标签，而circ-ZNF609的等位基因则仍是野生型，理论上导致能检测到的蛋白量减半，所以并未能通过western blot检测到内源蛋白的表达。研究者将目光转向蛋白质谱的方法，并在质谱的肽段比对中成功得到了circ-ZNF609的肽段（图4）。
综合以上结果，研究者证明了环状RNA circ-ZNF609具有翻译的能力，但是关于circ-ZNF609促进肌肉细胞发育的功能，研究者并没有解释这是环状RNA本身的功能，还是其编码的蛋白的功能。未来还需要更多的研究来探索该类新来源的蛋白的功能及机制。
以色列科学家Sebastian Kadener的文章《Translation of CircRNAs》则是通过生物信息学预测环状RNA的开放阅读框，结合核糖体展示技术的数据，分析可与核糖体结合的环状RNA，从而系统地分析了果蝇中具有编码潜能的环状RNA，表明环状RNA的翻译能力在进化上可能是保守的，并发现果蝇中大部分可翻译的环状RNA与其线性的mRNA共享翻译起始序列，暗示环状RNA翻译的产物与线性mRNA的产物具有类似的5’端结构（图5）。
以上三篇文章，在人，小鼠和果蝇中鉴定了一批具有翻译潜能的环状RNA，那么同样是非编码RNA的长非编码RNA可以翻译出蛋白吗？其实早在2011年，美国科学家Jonathan S. Weissman就通过核糖体展示技术发现有大量的lincRNA结合在核糖体上，表明它们有可能被翻译（图6）。黑点表示lincRNA，蓝点表示蛋白编码基因的编码区（protein-coding），可以看出有很多lincRNA与protein coding有相同的翻译效率（translational efficiency）。
2016年，Nature上发表John G. Clohessy和 Pier Paolo Pandolfi的研究成果《mTORC1 and muscle regeneration are regulated by the LINC00961-encoded SPAR polypeptide》，发现之前被鉴定为长非编码RNA的LINC00961有编码的能力，其编码的小肽SPAR可抑制mTORC1的活性。值得注意的是，研究人员制备了SPAR的内源抗体，证明该非编码RNA编码的小肽确实在体内存在。进一步的实验证明，如果突变小肽的起始密码子ATG，可以在不影响LINC00961表达的情况下，使小肽不表达，而这样的变体是不具备抑制mTORC1活性的功能的。该实验说明LINC00961以其编码的小肽发挥功能，而不是RNA本身（图7）。
看到这，大家是不是已经跃跃欲试了呢？小编要啰嗦几句，关于非编码RNA可编码的研究，还需大胆假设，小心求证。
2012年，nature chemical biology发表John L rinn和alan saghatelian的论文《peptidomic discovery of short open reading frame–encoded peptides in human cells》。该研究通过对蛋白质谱的分析，鉴定了新的小肽，并利用肽段序列比对回基因组来确定产生的新的小肽的基因。他们发现只有极少数的小肽来源于ncRNA，说明大部分ncRNA是不翻译的（图8）。
而2013年Cell上的文章，则更加直白，Eric S. Lander发表题为《Ribosome Profiling Provides Evidence that Large Noncoding RNAs Do Not Encode Proteins》，该研究认为，现在大部分关于非编码RNA可编码的研究都基于对核糖体展示技术的数据分析，不可否认，确实有很多非编码RNA结合在核糖体上，但这并不意味着它们被翻译了。得出这样惊人的结论，主要是基于核糖体在mRNA的结合是一个动态过程（图9.1）。40S的核糖体小亚基首先结合在5’UTR区，识别到起始密码子的时候，60S的核糖体大亚基才会与小亚基结合，形成80S的复合体。这样的翻译复合体在遇到终止密码时会分离开，所以理论上3’UTR是不应该存在核糖体结合的。传统的RNA翻译效率的计算，只考虑了RNA在核糖体上结合的数量，而没有考虑核糖体在RNA的非翻译区的释放过程，所以研究者重新定义了翻译效率的计算公式（图9.2），只有当核糖体在同一条RNA的翻译区（ORF）结合量明显高于非翻译区的结合量，才认为该RNA是被翻译的。经过这样的计算，大部分的lincRNA与mRNA的翻译区都区别开了（图9.3）
通过以上9幅图的梳理，我们可以看出，有关非编码RNA可编码的研究，一直非编码RNA领域的热点和难点，虽然个别环状RNA和长非编码RNA产生的小肽被证明有功能，但是大部分的研究多还集中在鉴定和预测上。如果想要在该领域取得突破的成绩，并不轻松，难点在与如何证明非编码RNA产生的小肽是内源的以及他们的功能机制又是什么。未来期待有更多的研究和方法，打开非编码RNA的编码大门！
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