软硬组织全透视，新型组织透明化技术“PEGASOS”全面介绍！
Texas A&M University赵瑚教授及四川大学华西口腔医学院联合培养博士生经典、张士文、罗文静等发明了一种新型全组织透明化技术“PEGASOS”（Polyethylene glycol (PEG) Associated Solvent System），相关成果于Cell Research杂志发表[1]，该方法首次实现了对动物软、硬组织同时透明化，在不破坏组织结构、不切片的情况下，可以直接进行三维显微拍摄，让深部组织感兴趣区域的神经、血管、标记蛋白等完整呈现。
图1 PEGASOS透明化技术实现小鼠全身透明化
近年来，大量组织透明化技术不断涌现，但适用条件均有限。
PEGASOS技术打破了各类传统组织透明化技术的局限，在高度保留组织荧光信号的同时，使全身透明无盲点：从小组织到全器官，从表浅到深部，甚至透过硬组织到软组织，PEGASOS均能得到兴趣区域单细胞水平分辨率的三维重建。简而言之，该项技术高度满足了三项经典评价标准：透明度更高、荧光更强、适用性更广泛。
基于PEGASOS的开发，赵瑚团队进行了小鼠全头血管重建、全脑内单神经元追踪、全脊柱内神经纤维追踪、以及长骨内神经血管重建与分析等挑战性尝试，为解决大量生物学基础问题提供了良好的技术平台，进一步实现了二维细胞分子学研究向组织器官生物学功能三维化的转变。
² 技术优势一：又透又亮
目前，透明化技术主要分为两大类：水性（基于亲水性液体的透明化技术）与油性（基于有机溶液的透明化技术）透明化技术。PEGASOS是一种新型油性技术，既克服了水性技术的缺点，例如透明度差、耗时长、组织膨胀等，亦弥补了油性技术易损伤荧光这一重大缺陷，因此PEGASOS能在保证荧光的同时达到前所未有的透明度。为实现这一目标，团队在脱钙、脱色、脱脂、脱水等方面均下了不少功夫，并且在不断尝试中发现修饰性PEG不同于传统PEG，在保护荧光方面具有独特优势，目前发现荧光能保留数月甚至更久，因此修饰性PEG作为透明液主要成分之一，PEG也成就了“PEGASOS”这一命名。
图2 PEGASOS透明化技术使各种软硬组织高度透明
图3 PEGASOS透明化技术具有强荧光保存能力
² 技术优势二：全脑成像
数十年来，组织透明化主要应用于脑组织领域，因而脑组织透明后成像质量已然成为考核透明化技术的主要标准。结合Thy1-EGFP转基因小鼠，PEGASOS能轻易完成全脑透明及神经重建，使用激光共聚焦显微镜（Confocal microscopy）高倍镜拍摄能追踪单个神经元走形。
图4 PEGASOS透明化技术使全脑神经追踪无障碍
目前，激光片层扫描显微镜（Light sheet fluorescence microscopy，LSFM）已成为拍摄三维组织标本最理想的选择之一。不同于激光共聚焦和双光子显微镜的单点或双光子激发，LSFM采用轴向光平面式扫描，实现了传统CLSM 100～1000倍的扫描速度。结合Tie2-Cre;tTAflox;tetO-H2BGFP转基因小鼠，PEGASOS透明后全脑在LSFM拍摄下可实现快速高质成像。
图5 PEGASOS组织透明化结合3I Light Sheet显微镜成像全脑血管
² 技术优势三：看透骨
相比于其他透明化技术，PEGASOS另一优势在于其在硬组织透明方面独具特色，连全身最硬组织-牙齿也不在话下。骨虽硬，其内部却囊括着极其柔软的各类组织，包括血管、神经、细胞等等，因此透过骨来观察其内部结构，无异于透过坚硬外壳来窥看其中神秘世界，乐趣无穷。
由于双光子荧光显微镜（Two-photon fluorescence microscopy，TPFM）一优势在于其能发生二次谐波成像（Second harmonic generation，SHG），这是一种非线性的光学效应，即从组织材料中发射的二次谐波波长正好是进入组织材料的光波长的一半。骨组织胶原正是一种非中心对称结构，SHG信号成像即可展示硬组织胶原结构，因此PEGASOS利用此概念已实现硬组织与内生荧光同时三维成像。
图6 PEGASOS透明化技术在透明硬组织方面极具优势
结合Thy1-EGFP转基因小鼠，赵瑚团队首次在全椎骨情况下观察脊髓中神经走向以及追踪背根神经节（DRG）走向，首次发现DRG发出神经纤维存在以等分形式分叉的类型。
图7 PEGASOS透明化技术观察脊髓神经走形
结合Wnt1-Cre；Ai14与aSMA-CreERT2；Ai14转基因小鼠，PEGASOS首次明确了长骨内神经与大血管分布及其中关系。
图8 PEGASOS透明化技术展示长骨内血管分布及神经血管关系
结合CDH5-CreERT2；Ai14转基因小鼠，PEGASOS首次进行了幼年小鼠全头血管重建。
图9 PEGASOS透明化技术观察低龄小鼠全头血管
PEGASOS也尝试应用于透明大鼠、狗组织，并能与各类免疫荧光染色，呈现厚组织的三维重建。
图10 PEGASOS透明化技术观察犬长骨骨单位
² 展望未来：
PEGASOS与PEGASUS谐音，承载了该方法能跨越天际、不断突破的美好愿景。目前，PEGASOS仅是起步，二三代技术正在开发研究中，只有不断突破，三维成像技术才会有更加广阔的天地。
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参考文献：
[1] D. Jing, S. Zhang, W. Luo, X. Gao, Y. Men, C. Ma, X. Liu, Y. Yi, A. Bugde, B.O. Zhou, Z. Zhao, Q. Yuan, J.Q. Feng, L. Gao, W.P. Ge, H. Zhao, Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method, Cell Res 28(8) (2018) 803-818.