Nature：发育中小鼠大脑的分子结构图谱
哺乳动物大脑的发育过程极其复杂，可能涉及一千多种不同的细胞类型。对这个过程的完整理解需要在大脑发育的整个时间和空间范围内对细胞状态进行系统表征。因此，在神经系统中使用单细胞RNA测序和空间转录组学的方式来揭示复杂组织的分子异质性的研究极具优势。
此前的研究探索了特定大脑区域、整个成人大脑甚至整个胚胎的发育。此项研究报告了胚胎期的小鼠大脑在原肠胚形成和出生期间的综合单细胞转录组图谱。
研究确定了近 800 种细胞状态，这些状态描述了大脑功能元素的发育程序。作者使用原位mRNA测序，绘制出了关键发育基因的空间表达模式。
本文将实测数据与单细胞簇群数据相结合，揭示了神经系统模式化过程中神经祖细胞的精确空间组织。
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研究者们使用基于液滴的单细胞RNA测序,分析了从胚胎日(E)7到E18之间胚胎期的小鼠大脑。研究发现，在所有的类型细胞中，细胞RNA总体含量随着胚胎年龄增长而下降，然后在最成熟的神经元中再次增加。
与成熟（剪接）RNA 相比，有丝分裂后细胞表达出更大比例的新生（未剪接）RNA。剪接体基因则显示出相反的模式，表明了一种在大脑发育过程中剪接速率调节的通用机制。
研究员们发现了798个细胞簇群（见图一）。图一显示了细胞主要按胎龄排列，而其分支们显示了主要的神经上皮谱系。在E7时，细胞在原肠胚形成过程中分为三个胚层。
神经嵴在E8-E10期间形成并在E10-E16期间分化为形成脑膜的成纤维细胞谱系。早期的神经管在E8形成，然后成熟为增殖的放射状胶质细胞，这也是所有神经细胞的前体。
图一：t分布随机邻域嵌入(t-SNE)（中心）显示来自215个胚胎的93个合并样本的292,495个细胞，按主要类别着色。从左上角顺时针方向开始，四个角插图显示解剖区域、标记基因表达、细胞周期评分和年龄（细胞及其25个最近邻细胞的平均孕龄）。
两大类神经元从神经管分支出来，一类包含前脑兴奋性神经元，另一类包含所有其他神经元类型。前脑兴奋性神经元的清晰分离与先前在成年小鼠大脑中的发现一致，表明这些细胞类型具有很强的转录和功能特化特质。
大约在E14之后，放射状胶质细胞逐渐失去增殖能力并转变为胶质母细胞状态，最终产生星形胶质细胞、室管膜和寡突胶质前体细胞。这些主要细胞的出现，揭示了哺乳动物大脑协调时间发展的秘密。
在原肠胚形成期间，神经板的前后轴是由外在信号建立的。相比之下，神经胚形成后的大脑形态，是由称为次级组织者的专门神经祖细胞发出的内在信号精心策划的。
研究人员通过已知的形态因子确定了E9-E11放射状胶质细胞样簇中的次级组织者（图二ad）。组织者亚型会表达大量不同的转录因子、分泌配体和表面受体，这些结果建立了丰富的二级组织者库。这些组织者进而分泌不同形态因子的组合，这些组合在特定的区域起作用，从而开启了不同区域神经元的命运。
簇状树状图的一个独特分支包括胶质细胞和相关的祖细胞（图三a），它揭示了两个主要团体：表达神经源性标记物的细胞和表达神经胶质标记物（图三b、c）。鉴于它们可能致力于胶质细胞的生成，我们将后者称为胶质母细胞。
研究发现两组之间有超过7,000个基因差异表达，并且胶质母细胞优先表达于星形胶质细胞和寡突胶质细胞相关的基因（图三d）。在前脑、中脑和后脑中，作者发现其中起源性的胚胎非端脑胶质母细胞和寡突细胞前体，与端脑胶质母细胞具有差异性（图三a）。
这些观察结果表明区域化的丧失，这一表现在寡突胶质细胞谱系中更加明显。进一步的研究表明，E12和E16之间发生了神经元到胶质细胞的转变（图三e）。
最早的星形胶质细胞出现在大约E15。巨噬细胞和小胶质细胞从胚外卵黄囊发育并在E9.5之前侵入大脑。作者早在E8就观察到增殖的巨噬细胞并持续到E14，进而逐渐被小胶质细胞和血管周围巨噬细胞取代（图三h，i）。
图三：a，代表放射状胶质细胞和相关细胞的簇状图。簇状图被切成15个元簇，标注在t-SNE上。b，由神经前体Neurog2和Dlx2表达的总和着色的细胞。c，由Tnc和Egfr表达总和着色的细胞。d，按星形胶质细胞（顶部）或少突细胞前体（底部）分数着色的细胞。e，来自指定孕龄的细胞在每个t-SNE图上都被着色。f，包含成纤维细胞的树状图进化枝中的簇。颜色表示Mkx、Col15a1和Slc22a2的表达。g，按胎龄着色的细胞。h，包含免疫细胞的簇状图。i，按胎龄着色的细胞。
发育过程中的大脑在不同空间域中会表现出具有特征的转录因子。随着时间的推移，这些空间随着可扩散的形态因子和细胞-细胞接触的区域相互作用来进行表达。
在将这一复杂过程与转录细胞状态联系起来的过程中，我们对E10.5（图四a，b）小鼠胚胎的24个矢状切面进行了119个基因的原位杂交测序（图二c）。我们通过单细胞 RNA 测序鉴定出的底板、顶板和边界组织者（图二），它们在空间上处于隔离状态并表达不同的分泌配体和受体组（图四f）。
观察表明，即使是出生在相邻空间域中的祖细胞也会受到几种不同的环境线索的影响。
图四：a，原位测序实验概述，包括119个基因和24个冷冻切片；执行了两次，结果相似。b，显示单个切片上五个基因的原始表达数据的示例。c,d,手动注释的解剖区域(c)和推断的分布(d)。206和347在与b相同的部分。e，估算的Prdm12和Six1表达。f，腹侧（橙色）和边界（蓝色）组织者的推断空间分布。g，位于发育中的眼睛、耳朵和鼻子。特写图像显示相邻部分的空间分布。
大脑发育的核心问题之一涉及到神经元多样性的起源。研究发现放射状胶质细胞在空间和转录上是多样的（图二、四），并且分泌出更多种类的可扩散形态因子，从而提供精确的局部线索来指定神经元细胞类型。
同时，研究观察到87个放射状胶质细胞亚型，但只有171个神经母细胞和306个神经元亚型。从放射状胶质细胞到成神经细胞的转变以几个突然的变化为标志：细胞周期退出，剪接活性突然增加和转录因子的表达所特有且稳定不变的模块。
总 结总结
这些观察支持了一个模型——神经祖细胞广泛地由次级组织者构成，但大多数神经元的多样性是在有丝分裂后的神经母细胞和成熟神经元中产生的。本研究的图谱概述了胎儿期大脑转录组的多样性，这是研究哺乳动物神经系统发育的重要部分。
研究中得出的关于时间、谱系和区域特异性基因表达的丰富信息，可以在今后为基因靶向、理解神经发育障碍和脑癌相关的基因等研究提供强大的支持。
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41586-021-03775-x
参考文献
La Manno, G., Siletti, K., Furlan, A. et al. Molecular architecture of the developing mouse brain. Nature 596, 92–96 (2021).
https://doi.org/10.1038/s41586-021-03775-x
编译作者：Ayden（brainnews创作团队）
校审：Simon（brainnews编辑部）