神经科学领域里程碑！全面构建人类大脑单细胞图谱｜追问顶刊
大脑是人类神经系统最为高级的部分，负责接收并发出我们日常生产活动中的各种指令。有关大脑的研究极具挑战，人类距离理解大脑还有多远的距离？多年来，不同国家的科学家都在试图破译大脑这一复杂而又精密的器官。
2013年，美国国立卫生研究院（NIH）启动了“美国脑计划”，全称为“使用创新神经技术的脑研究计划”（Brain Research Through Advancing Innovative Neurotechnologies Initiative, BRAIN Initiative）。2017年起，随着单细胞测序技术和单细胞成像技术的高速发展，BICCN（BRAIN Initiative Cell Census Network）项目启动，这是一个由分布在美国和欧洲的研究团队组成的联盟，旨在用前沿技术对小鼠、非人灵长类动物和人类大脑的细胞类型进行识别和分类，以及针对特定细胞类型开发新的遗传工具。
2023年10月13日，BICCN计划的科学家在Science及其子刊Science Advances和Science Translational Medicine上共发布了21篇相关论文，发布了迄今为止最大、最全面的人类、非人灵长类脑细胞图谱，揭示了超过3000种脑细胞类型，其中许多发现都具有“首创性”。
▷图 1:Science与Science Advances杂志封面合并为一个完整人类大脑图像。图源：Science官网
早在2021年10月，Nature杂志曾一次性上线16篇研究论文，报告了BICCN项目的阶段性研究成果，其主要强调在分子水平上全面绘制哺乳动物初级运动皮层细胞类型的特征。与两年前的研究不同，此次Science新发布的专题主要聚焦于人脑，尤其是从单细胞层面以前所未有的颗粒度综合转录组学、蛋白质组学、表观遗传组学解析了人脑的组织结构[1]。
这些研究主要围绕四个主题进行：
（1）成体人类及非人灵长类动物单细胞图谱；
（2）成体人类与非人灵长类单细胞图谱比较研究；
（3）人类特殊细胞类型的建模分析；
（4）人类及非人灵长类单细胞发育图谱。
这些研究识别和描绘出了人脑细胞类型的惊人多样性，为认识人类精神和神经疾病的机制提供线索，也让我们对人类这一物种的身份有新的认识。接下来，追问将带领读者一起了解相关的研究成果。
▷图 2：综合使用转录组学、蛋白质组学、表观遗传组学对人脑组织进行研究。图源：参考文献[1]
成体人类及非人灵长类动物单细胞图谱
第一个研究由瑞典卡罗林斯卡医学院Sten Linnarsson和荷兰乌得勒支大学医学中心的神经科学家Kimberly Siletti团队领衔[2]。他们从三位死者的前脑、中脑和后脑106个部位采集了300多万个单一细胞进行RNA测序（snRNA-seq），深入研究了脑细胞的多样性和亚型，为整个图谱的建立打下坚实的基础。
通过对测序数据展开分析，他们确认了461个脑细胞大类，包括3313个细胞亚群，其中约80%是神经元，其余是不同种类的神经胶质细胞（图3）。
▷图 3：成人大脑细胞类型的区域特异性。图源：参考文献[2]
研究人员发现，除了大脑皮层外，神经元的种类非常多样化。尤其是在下丘脑、中脑和后脑，神经元的多样性非常明显，并且与它们不同的功能密切相关。值得注意的是，研究人员发现脑干是神经元多样性最丰富的脑区，并且其中一些细胞控制着先天行为，如疼痛反射、恐惧、攻击、性行为等。这些神经元的结构不像大脑皮层的神经元那样有明显的分层结构。很多神经元同属一个超级细胞簇，这个超级细胞簇包含不同类型的神经元，包括抑制性和兴奋性神经元。
此外，研究人员还发现，虽然某些大脑区域具有不同的细胞类型，但许多区域的主要差异在于共享细胞类型组的相对比例。其中，连接大脑和脊髓的脑干有很多不同类型的神经元。来自美国西雅图艾伦脑科学研究所的Nikolas Jorstad等人的研究结果也得出了这一结论。他们对成人大脑皮层的八个区域进行了分析，结果表明大多数区域都包含相同的主要细胞类别，不同之处主要在于每种类型的比例以及非神经元细胞所在的皮层[3]。
有趣的是，初级视觉皮层（V1）似乎是个例外：V1区拥有几种特异性的抑制性神经元类型，是人类和其他灵长类动物在这一区域特有的[3]（图4）。总体而言，这些数据支持区域功能多样化的进化策略，该策略在很大程度上不依赖于新细胞类型的产生，而是利用细胞类型内的微小变化及其相对分布的变化来构建不同的环路。
▷图 4：除V1外，大脑皮层所有区域的兴奋性神经元和抑制性神经元的比例相似。图源：参考文献[3]
除了区域差异性外，脑细胞的基因表达还存在个体差异。其中一项研究首次使用单细胞技术比较了大量个体的脑组织后得出了这一结论。在这项工作中，75名因为难治性癫痫或脑部肿瘤而接受外科手术的成年志愿者向科学研究提供了珍贵的大脑皮层样本，研究人员对颞中回的脑细胞类型组成和细胞基因表达的变化展开了详细分析（图5）。结果显示，尽管不同个体之间存在高度一致的细胞构成，但也存在可以反映出个体特征、疾病状况和遗传调控变异的大量变异。这些结果也为未来研究健康和疾病状态下的细胞分型提供了参考[4]。
▷图 5：转录组学（snRNA-seq）和基因组学（WGS）分析揭示人类皮层细胞类型的个体差异。图源：参考文献[4]
来自美国索尔克生物研究所的分子生物学家Joseph Ecker的团队，则从表观遗传学角度来剖析大脑。2020年，Ecker教授领导的研究团队根据DNA上的甲基化标记，分析了小鼠大脑中的160多种细胞，这种方法可以解析基因的“开关状态”。此次，他们使用同样的工具分析了三个成年男性捐献的大脑，对46个脑区的50多万个细胞展开DNA甲基化模式的分析，确定了近200种脑细胞类型。
与此同时，研究人员还对每个细胞基因组的三维结构进行分析，以便了解DNA序列中哪些片段可能正处于被积极读取的状态（图6）。研究发现，神经元和非神经元之间的染色质接触距离存在明显差异，这对于理解基因调控有很大的帮助。最终，研究团队构建了一个人类大脑的单细胞DNA甲基化和三维基因组结构图谱，阐明了大脑各部分细胞的特异性以及其多样化的表观遗传学结构[5]。
▷图 6：成体人脑表观遗传学图谱。图源：参考文献[5]
以上研究使用单细胞转录组和表观基因组分析表征了人脑与非人灵长类动物全脑的特征，揭示了大脑神经元类型惊人的多样性，为细胞类型多样性在人类大脑区域和物种特异性差异中的作用提供了新的视角。Ecker表示，“这些数据丰富的研究为在大脑中寻找特定疾病的位置提供了非常好的线索”。
成体人类与非人灵长类单细胞图谱比较研究
大脑细胞的哪些特征是人类与非人灵长类动物所特有的，也是BICCN项目想要回答的一个关键问题。
为此，Jorstad等人对成年人类、黑猩猩、大猩猩、猕猴和普通狨猴的颞中回（对语言理解至关重要的区域）进行了单细胞转录分析。他们发现，尽管灵长类动物在很大程度上具有相同的保守细胞类型，但它们在细胞比例方面表现出巨大差异。值得注意的是，尽管一般来说神经胶质细胞的多样性低于物种内的神经元，但与神经元相比，小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞在物种之间表现出更大的转录差异，并且在转录组中具有更快的进化趋异。只有几百个基因显示出人类特有的表达模式，并且这些基因不成比例地靠近具有人类进化选择迹象的基因组区域。这些结果表明，成年人类皮层的特定特性可能源自相对较少的细胞和分子变化[6]（图7）。
研究组还有一个有趣发现，尽管黑猩猩和人类有着更近的共同祖先，但黑猩猩的神经元特征与大猩猩更接近，而不是与人类更接近[6]。
▷图 7：人类、黑猩猩的大脑皮层颞中回（MTG）显示出高度相似的细胞类型组成和分层结构。图源：参考文献[6]
另外，还有两项研究重点分析了在小鼠中没有、但在人类大脑中发现的细胞类型，例如根据外形命名的“双花束细胞”（double-bouquet cell）[7]、“玫瑰果神经元”（rosehip neuron）[8]。
艾伦脑科学研究所的Brian Lee等利用快速病毒基因标记和膜片钳电生理学结合RNA测序（Patch-seq），靶向神经外科手术切除的活组织，从中分析了这些神经元，包括它们的放电特性、复杂的形态学，以及开启的基因，证明了多模式Patch-seq数据对于转录组细胞类型分类学的细化至关重要。这项工作可以作为未来人类脑细胞类型功能研究的路线图，以解决新兴的转录组细胞类型分类学的问题，并提供丰富的开放数据集，用于探索各种人类新皮层GABA能神经元类型的基因功能关系[7]。
同样来自艾伦脑科学研究所的Thomas Chartrand等则利用单细胞转录组学来定义人类和小鼠大脑皮层L1中的神经元细胞类型，并定量识别了跨物种的同源亚种。他们观察到的跨物种差异表明，人类和小鼠对新皮层回路高阶输入的调节存在差异[8]。
▷图 8：利用新技术分析人脑皮层中多样化的GABA能神经元。图源：参考文献[7]
这些研究着重于对人体及非人灵长类动物大脑细胞组成进行单细胞比较分析。由此我们得知，一些将人类与灵长类动物区分开来的变化，导致了更高的认知能力，但也使我们面临更大的疾病风险，通过了解这些差异可以解开疾病风险的原因。
人类特殊细胞类型的建模分析
人类基因组中有数以万计的序列变异与神经精神疾病的病因相关，但它们主要位于编码区之外，因此解释这些已知风险变异的作用始终是一大挑战。这些非编码疾病风险变异可能通过扰乱转录调控元件来发挥作用，调控与神经精神疾病相关的细胞的基因表达，而转录调控与染色质的可及性密切相关。
为厘清其中的关系，美国加州大学圣地亚哥分校任兵课题组在单细胞水平上进行了人类大脑染色质可及性的综合分析，涉及42个不同脑区的110万个细胞。他们使用这个染色质图谱定义了107种不同的脑细胞类型，并揭示了这些细胞类型中54万个推定的转录调控元件的染色质可及性状态，以及特定脑细胞类型与精神分裂症、双向情感障碍、阿尔茨海默病、重度抑郁症等19种神经和精神疾病之间的关联。其中近三分之一的转录调控元件在小鼠脑细胞中表现出保守性和染色质可及性，强调了其功能重要性[9]。
此外，他们还开发了机器学习模型来预测疾病风险变异的调节功能。该图谱结合其他分子和解剖学数据，有望促进人们对脑功能和神经病理学的理解，最终为解决神经精神疾病提供更有效的方法。
▷图 9：对染色质可及性的单细胞测序分析。图源：参考文献[9]
以上这组研究对人类神经元细胞的类型、功能进行了解剖分析，并解析了活体组织的细胞特性。大脑由许多类型的细胞组成复杂的环路，可以根据其分子、电生理和形态特征分为多种细胞类型，许多细胞类型在脑环路的计算中起着不同的作用。此外，脑部疾病并不平等地影响所有细胞类型，鉴定受每种疾病影响的主要细胞类型可以为有针对性地干预和治疗提供依据和启发。
人类及非人灵长类单细胞发育图谱
在这一系列论文中，有4篇重点关注了大脑的发育过程。
人的大脑皮层在胎儿出生前数月开始发育，并延续到出生后数月。该过程会受到精细调控，不同细胞的生长、分化和成熟，对大脑的复杂结构和功能至关重要。为了跟踪大脑皮层的发育轨迹，美国加利福尼亚大学旧金山分校Arnold R. Kriegstein团队，从不同阶段的人类皮层样本中收集了大量小核RNA测序（snRNA-seq）数据，对产前和产后发育阶段人类皮层样本中生成的单细胞数据进行了单细胞轨迹分析[10]。
该研究阐明了人类皮层谱系发育背后的分子变化。通过整合单细胞转录组表达和染色质可及性图谱，他们绘制了一个全面的皮层谱系图谱，涵盖了产前和产后发育，确定了关键的转录网络，突出了性别特异性的发育变化。总之，这项研究成功揭示了正常皮层发育的谱系特异性机制以及性别二态基因表达在自闭症发病机制中的作用。
▷图 10：不同发育阶段的细胞类型和分子特征变化。图源：参考文献[10]
在此基础上，Emelie Braun等人对至关重要的人类发育前三个月的大脑进行了全面研究，绘制出了全面的皮层谱系转录组图谱[11]。
他们发现，尽管神经元是最多样化的，但前星形胶质细胞和少突胶质细胞前体细胞在各区域也都是不同的，它们的基因表达差异表明其具有区域特异性和细胞类型特异性的支持功能（图11）。这些发现强调了早期模式事件的重要性，并为确定影响特定脑细胞群体的人类疾病的治疗靶点提供了丰富的数据资源。此外，研究还确定了皮层发育时的关键转录网络，以及性别特异性的发育变化，对探索发育性大脑疾病、自闭症有重要意义。这也是科学家首次对大脑发育前三个月进行全面研究。
▷图 11：胚胎前三个月的人类大脑细胞图谱。图源：参考文献[11]
美国耶鲁大学医学院Nenad Sestan和Pasko Rakic的团队则借助恒河猴的样本，关注了整个端脑的发育过程，以及在此过程中调节神经细胞空间分布的分子过程[12]。
研究团队解剖了恒河猴产前端脑的多个区域，并对76.1万个细胞进行了单细胞转录组测序（scRNA-seq），他们区分了转录组定义的细胞亚型，包括背侧和腹侧神经干细胞、兴奋性和抑制性神经元、胶质细胞和非神经细胞，并描述了它们在谱系发育过程中跨区域的分子动力学特征。不仅确定了端脑组织中心的早期祖细胞，还预测了协调其模式功能的基因调控网络，包括ZIC转录因子。
这些数据资源为未来进一步探索灵长类动物和人类大脑的发育、进化和疾病铺平了道路。
▷图 12：恒河猴端脑发育图谱。图源：参考文献[12]
最后一篇论文关注的是丘脑的发育过程。丘脑是大脑与外界沟通的关键节点，并且哺乳动物的丘脑核团数量与投射模式相对保守。来自加州大学旧金山分校的Tomasz Nowakowski团队重点分析了人类丘脑发育时的细胞类型和空间组织等特征[13]。
▷图 13：人类丘脑发育时的细胞类型和空间组织等特征。图源：参考文献[13]
根据分析结果，在妊娠早期，丘脑会出现神经发生，产生谷氨酸能和GABA能神经元；到妊娠中期，谷氨酸能神经元会分化成两种亚型，而丘脑中GABA能神经元数量会显著增加，并开始广泛分布。研究结果提示，该GABA能神经元群体可能有助于人类进化。除此之外，他们观察到神经胶质细胞的空间分辨模式，以及随时间的发生与成熟过程，比如星形胶质细胞的两种亚型，一种会在丘脑富集，另一种则会在丘脑附近的大脑区域富集。这些结论有助于帮助理解人类大脑进化过程，尤其是提升对丘脑发育的认知。
除了上述发表在Science上的12篇文章，还有8篇研究发表在Science Advances杂志，由René Wilbers领导的工作探索了人类的快速脉冲中间神经元是如何在神经元到神经元的距离比老鼠大的情况下保持快速同步频率的。发表在Science Translational Medicine杂志的1篇研究中，Seth Ament及其同事聚焦于生命早期的炎症，这是决定临床上几种神经系统疾病的危险因素。他们专注于小脑区域研究，发现炎症主要与浦肯野神经元和高尔基神经元这两种抑制性神经元亚型的变化有关。
在对这一系列工作的总结中，NIH脑计划主任John Ngai博士评论道：“目前的一系列研究代表了一个里程碑式的成就，为进一步阐明人类大脑在细胞水平上的复杂性架起重要桥梁。”
一百多年前，Santiago Ramón y Cajal绘制的神经元图像为我们理解大脑中细胞类型的多样性和复杂性开启了一扇大门，由此神经科学开启了对大脑细胞类型和大脑功能的研究。如今，BICCN通过全球性的大规模合作，对人类大脑的基本知识进行了全面的、高分辨率的描述。
BICCN这些研究的广度和深度证明了这种大型合作倡议在产生人类大脑基础知识方面的潜力。这一巨大进展将为了解人类大脑如何形成以及人类神经系统疾病的研究提供宝贵的资源，同时也为理解人类大脑的构成和功能奠定了基础，并为人类神经系统疾病病因的探究开辟了一个新时代。
论文集链接:https://www.science.org/collections/brain-cell-census
关于TCCI
天桥脑科学研究院（Tianqiao and Chrissy Chen Institute，TCCI）是由陈天桥、雒芊芊夫妇私人出资10亿美元创建的，旨在聚焦AI＋脑科学，支持、推进全球范围内脑科学研究，造福全人类，目前已经成为知名的支持人类脑科学研究的科研机构。
TCCI一期投入5亿元人民币支持中国的脑科学研究，与上海周良辅医学发展基金会合作成立上海陈天桥脑健康研究所（又名TCCI转化中心），致力于提升脑健康和脑疾病治疗研究和成果转化。后又与华山医院、上海市精神卫生中心等建立战略合作，设立了应用神经技术前沿实验室、人工智能与精神健康前沿实验室。在国际上，TCCI与加州理工学院合作成立TCCI加州理工研究院，设脑机接口、社交与决策神经科学、系统神经科学、分子与细胞神经科学、大脑成像、神经科学教育等多个中心，重点关注大脑基础研究。TCCI还在北美、亚洲、欧洲、大洋洲主办、资助了200多场高质量的学术会议。