深度解析: 韩春雨NgAgo论文为何被饶议为诺奖成果之后即坠入质疑漩涡中？
1.
质疑声中韩春雨其人,
绝非科媒炮制的三无草根型学者，
而是名门出生、且有足量基金资助。
中文名：韩春雨
英文名： Chunyu Han
性别：男
出生日期：1974年1月
籍贯：河北石家庄
身份：基因科学家
就职院校：河北科技大学生物科学与工程学院
职称：副教授
出生名门：中国农科院硕士、协和博士
网红前基金支持：
1） 国家自然科学基金30700143：一个新的alpha-N Catenin 相互作用蛋白的鉴定及此项互作用的功能研究 ,主持34万元 ;
2）国家转基因重大专项课题2009ZX08002-005B 抗蚜转基因小麦新品种培育任务一 抗蚜目的基因克隆及高效、特异转化体系的构建、改造及遗传转化 200万元，任务负责人;
网红后大基金支持：
1）2016年国家自然科学基金100万
2）河北发改委2'24亿基因编辑中心
2.
质疑声中韩春雨其事
韩春雨在2015年05月02日之前的事大多不为人所知，这天之后，因为《自然-生物技术》(Nature Biotechnology, 以下简称NBT）发表了一篇文章：DNA-guided genomeediting using the Natronobacterium gregoryi Argonaute Feng Gao, Xiao Z Shen, Feng Jiang, Yongqiang Wu & Chunyu Han doi:10.1038/nbt.3547
3.
对韩NgAgo论文的质疑是什么？
何被饶议为诺奖成果之后旋即坠入地狱？
2016年7月起，关于NgAgo实验无法重复的质疑声渐起，并随着前后发表在《蛋白质与细胞》、《自然-生物技术》的质疑性评论文章而达到高潮。直至今日，“韩春雨实验无法重复”仍然横亘在NgAgo成为“基因剪刀”的路上。
针对NgAgo技术的质疑是限于特定范围的，划定范围边界的是韩春雨发表的NgAgo论文。在论文中，韩春雨报告称，他在哺乳细胞系统中使用NgAgo技术，以DNA为向导，对DNA双链进行了高效的切割。“哺乳细胞”、“高效”、“切割DNA”，这都是韩春雨的NgAgo论文必不可少的关键词。如果没有这些关键词，NgAgo难以登上具有40多个影响因子的国际期刊《自然-生物技术》，没有这些关键词，NgAgo也不会引来全球实验室对它的争相试验。
之所以这么说，是因为Ago蛋白酶具有基因编辑的潜力早在2014年便被科学家约翰·范德欧斯特（John van der Oost）所证实，只不过Ago家族的酶大多需要在60摄氏度以上的环境中有活性，这意味着在哺乳细胞中没有实用性，无法为人类所用。再者，第三代基因编辑技术CRISPR在实验室的表现良好，如果一项技术不如CRISPR高效，这项技术也无法带来突破。
总结：对韩春雨NgAgo论文的质疑，是按照论文中的实验操作，无法实现在哺乳细胞中高效的基因编辑。
时至今日，这篇文章引发了许多故事，已有不少读者拜读了韩大作。笔者试问：韩春雨NgAgo论文为何被饶议为诺奖成果之后旋即坠入地狱？这一具有历史节点性学术科研质疑持续了近8个月，而《自然-生物技术》撤文的最后通牒之期即将结束，所以有必须重新温习韩原始论文，并逐图解读。为了使解读结果尽量完整，也将其他科学家公开的代表性不能重复韩春雨结果的论文放在了一起解读（包括DOI10.1007/s13238-016-0343-9以及DOI: 10.1038/nbt.3753）。同时，也为了使解读结果更客观，将结果放到公众平台，请各位同行批评指正。本文版式尽量按原文顺序，方便读者查阅。
4. 韩文前言炮轰Cas9,
但不知NgAgo是一个什么样土炮？
韩春雨老师的前言部分和绝大多数文章一样，都很套路。首先以目前大热的CAS9作为切入点，文中说虽然这个东西目前效率高，应用广，但是有不少缺点，比如说脱靶效应、易形成二级结构等等。然后用AGO蛋白与之相比，认为后者可以克服CAS9的缺点，所以很有用，于是韩春雨老师就做了这个研究…. 这个前言视乎高大上，完成可以藐视一切。但是，这就是无知者勇、或故意隐瞒NgAgo及其Ago家族研究背景。
（1）基因数据库两个名称不同基因比对结果提示：100%一致，这说明NgAgo不是韩春雨首次克隆。
（2）NgAgo属于Ago家族成员，在siRNA和siDNA效应中Ago作用机制，即使DNA-结合的Ago甚或哺乳细胞Ago都已有很多研究，但韩只字未提。
5.
韩文结果
与其他不能重复的数据对比
其实，在之前的研究中已经有人发现了这个AGO蛋白切割RNA或DNA，不过原核Ago切割DNA的活性温度必须达到65°C，但是哺乳动物的酶活性温度通常在35°C ~37°C，所以就在BLAST数据库中进行筛选，最终锁定了Natronobacterium gregoryi中的Argonaute蛋白，这也是NgAgo的来源。
为了证明NgAgo能与ssDNA结合，韩春雨老师从E.coli（可产生5'-磷酸化的ssDNA和ssRNA）纯化出了NgAgo，并用RNase A和DNase I消化，发现核酸能够被DNase I消化，而不能被RNase A消化（Fig.1a），说明与NgAgo结合的DNA而不是RNA。
接下来，就是验证NgAgo是否与设想一致：在37°C能够切割靶DNA，如果不能切，那就不能NBT了。
韩先是设计了3条5'-磷酸化的ssDNA（其中FW和RV互补并靶向pACYCDuet-eGFP质粒，还有一条NC对照）代替天然核酸，与NgAgo共转染。然后又设计了5'- 有或没有磷酸化的DNA和RNA。韩果提示, 只有在FW和RV与NgAgo共转时才能切割质粒，说明DNA能够引导NgAgo酶切DNA（Fig.1b），而且DNA的5'-端需是磷酸化的（Fig.1c）。
这部分结果是为了证明NgAgo蛋白能够在5'-磷酸化的DNA引导下，在37°C酶切DNA。
这是文章的门槛，有了这一步，才能够继续往下走。
Fig.1
但是，在Shawn等20多位科学家的结果并不支持韩的结果(Fig.S1)。虽然TtAgo和MpAgo能够分别在75°C和50°C切割ssDNA (这在2014年已经被报道)，但是NgAgo却不能在37°C发挥其酶活性，就是50°C和75°C也均不具酶活性(Fig.S1A)。即使按照韩文中的要求设计gDNA(G5，G10，G27，G28)，也不能在293T细胞中实现对Dyrk1a、Emx1的基因编辑（Fig.S1B）。
Fig.S1
根据韩自己的结果，他继续探索NgAgo能够在动物细胞中编辑基因组。
在模式动物细胞293T中，并没有发现内源性的5'-磷酸化DNA与NgAgo结合（Fig.2a），说明内源性的DNA并不会导致NgAgo出现脱靶效应。转入NgAgo蛋白24h后再转入外源性NgAgo的5'-磷酸化DNA，发现DNA减少（Fig.2b）。且从293T细胞中纯化的NgAgo蛋白不能在37°C与DNA结合，但能在55°C发挥其DNA酶切活性（Fig.2c）。示意图见（Fig.2d）。
Linzhao Chen老师在重复之后却得到了不一样的结论，认为NgAgo在293T细胞中的基因编辑效果是“Negligible”（微不足道的）。
为了确定NgAgo蛋白的酶切位点，韩对质粒进行测序，结果发现，NgAgo与TtAgo一样，都能在靶序列上形成多个碱基的突变，而不是发挥核酸外切酶活性。为了进一步证实该结论，韩将孵育时间延长到72h（Fig.3a），结果发现靶标位置内的20个核苷酸被随机移除（Fig.3b）。实验结果证明NgAgo蛋白并不是一种核酸外切酶。
接下来，韩还设计一个检测系统来评估NgAgo蛋白的效率：共转染pEGFP-N1质粒，NgAgo表达载体质粒和靶向于CMV启动子和eGFP编码区的ssDNA（不同长度）；同时设计了另外一个系统：共转染pEGFP-N1，一个Cas9表达载体和sgRNA表达载体（可靶向于pEGFP-N1）。这样不仅可通过评估eGFP的表达量来反应NgAgo的效率，还能够对两者的效率进行比较（Fig.3c）。韩下了一个视乎“谨慎”的结论：that the NgAgo-gDNA system was as efficient in inactivating eGFP expression as the Cas9-sgRNA system (NgAgo与CAS9一样有效)。但， 从图中反应出来的结果来看，似乎比CAS9效率更高。同时得出另一个结论：gDNA的最佳长度在24nt（Fig.3d）。
Feng Gu等人在HEK-293细胞里面并没有观察到NgAgo对GFP表达有明显影响（Fig.S2）。
Fig.3
Fig.S2
接下来就是，对NgAgo蛋白编辑内源性人类基因组的可能性进行了探索。这一步是该研究的重中之重，也是引发科学争议的最关键结果。
韩选择的对象是DYRK1A基因，并针对该基因设计了gDNA，NgAgo蛋也经过改进（N端加了一个核定位信号）。实验结果不出所料，是“非常”有效（Fig.4a）。同时，针对其他基因设计的47个靶位点gDNA，它们的编辑效率都是一样的好（Fig.4b）。在多种动物细胞也都能得到一样好的结果（Fig.4c）。
在gDNA引导过程中碱基错配可能导致和预想截然不同的编辑结果。因此，韩继续探索了碱基错配对NgAgo蛋白的影响。还是以DYRK1A为靶标，gDNA（长度为24nt）中每个位置都引入一个突变碱基。发现NgAgo对碱基突变特别敏感，至少降低73%的编辑效率，其中又以8-11位的碱基最为关键，可降低至少85%的编辑效率。一旦错配碱基数目达到3个，NgAgo的基因编辑效率基本完全丧失（Fig.4d）。同时，韩还研究了单碱基突变对NgAgo的敏感性是否会随着gDNA的长度变化而改变。这次设计的gDNA长度为21nt，结果与24nt的gDNA类似，在21nt长度的gDNA中任何位置的单碱基突变都会改变NgAgo的编辑效率，且敏感性更高，8-11位的碱基同样是最敏感的位置。而Cas9最高可以容忍5个碱基的错配，所以韩春雨老师认为这是NgAgo具有低脱靶效应和高保真性的原因之一。
接着韩又利用DYRK1A基因来比较Cas9与NgAgo的编辑效率，得到的结果是：comparable efficiencies (31.97% for NgAgo vs. 32.2% for Cas9)（Fig.4e）。由于RNA在GC富集区域很容易产生二级结构，而DNA不会。因此，韩继续检测NgAgo是否在该区域比CAS9更有优势，结果证明，NgAgo在GC富集区的切割效果果然明显好于Cas9（Fig.4f）。
但是， 在完全相同的条件下，20位科学家的独立实验室也无法重复韩春雨老师论文的结果（Fig.S3）。NBT杂志社的独立科学家也得出了同样不可重复的结果（Fig.S4）。数据来源：(A)Shuo Lin; (B) Zhiwei Huang; (C) Wei Li;(D) Jing-Wei Xiong; (E) Junjiu Huang and Zhou Songyang; (F) Wensheng Wei; (G) Hui Yang; (H) Haoyi Wang.
Fig.4
Fig.S3
Fig.S4
CAS9 作为目前最为广谱应用的基因编辑工具，是因为该技术不仅能够敲除，还能够敲入。韩也设计了一套reporter系统在哺乳动物基因组中对NgAgo的该功能也进行了探索（Fig.5a），该系统包含一个donor DNA片段（包含一个报告基因和G418抗性基因）。结果表明NgAgo不仅可以准确插入目的基因（Fig.5b），而且通过G418的筛选，重新利用NgAgo系统靶向于TGA终止子区后，还能在该终止区进行非同源末端连接修复（NHEJ）（Fig.5c）。更重要的是，效率还很不错（Fig.5d）。
Fig.5
6.
韩文讨论
韩对自己发现的NgAgo优势进行了总结：
一是高效切割哺乳细胞DNA实现基因编辑；
一是低脱靶效应（容错率低，保真性高，与5’磷酸DNA特异结合）；
二是gDNA不要求PAM序列，易于设计合成和推广。
但是，韩国论文中，金镇洙没有否定两个月前那篇评论通信文章的结论，再次在文章中提到了无法重复实验。但他发现了关于NgAgo另一个特性——在体外，NgAgo能作为一种DNA引导的核酸内切酶切割RNA。这意味着NgAgo或许可以作为“RNA干扰”的一种工具发挥作用。RNA干扰的一种形式是基因沉默，也就是让特定基因不表达，这可以用在疾病治疗上，通过让致病基因“沉默”来达到治疗效果。
7.
笔者综合评论
自从韩论文面世后，其本人就受到了极大的关注，也给他自己带来了很多荣耀和光环。但是随着事件的发酵，很多原来支持的韩人都对该论文的真实性抱以科学质疑的态度。当然，也有不少学者从一开始就以冷静的态度观望。
尽管期间南通大学刘东在《Cell Research》（doi.10.1038/cr. 2016.134. Fig.S5)的研究成果证明NgAgo确实有效，然而这是通过基因敲减（Knockdown）实现的，并不是基因敲除（Knockout）: 两者相差十万八千里的概念。而根据韩国首尔大学Jin-Soo Kim（NBT独立重复实验的科学家之一）的最新成果显示(doi.http://dx.doi.org/10.1101/101923. Fig.S6），NgAgo切割的是RNA，而不是DNA。NBT杂志曾让韩在2017年1月底之前对争议进行回复。根据NBT最新消息，该杂志已获得了与NgAgo系统可重复性相关的新数据但不是原始数据，在决定是否采取进一步行动之前，杂志需要调查研究这些数据。但根据网友观点（根科学网博客整理http://blog.sciencenet.cn/home.php?mod=space&uid =2554763&do=blog&id=1029470），又知Jin-SooKim作为基因编辑领域的权威，已经数次发文证明了NgAgo对于DNA编辑的无效性，基本上可以给韩NgAgo盖棺定论了。因此，如果韩想要证明自己是正确的，必须提供其原始数据或重复实验的新数据（用以反驳Jin-SooKim老师）。
只有原始实验记录，用以证实该论文的真实性。除此之外，别无选择，就算找再多的国外公司合作也是枉然，扯虎皮也做不了大旗。但从论文发表到现在杂志声明的截止日期，已超过半年有余，时间足够充裕，仍未见韩拿出有价值的数据。希望韩尽早、尽快地将相关数据公布出来，以证明自己的清白。至于争议事件后续实际会如何发展，我们拭目以待。
另外，一度支持韩春雨老师的澳大利亚基因学家盖坦·布尔焦(Gaetan Burgio) 7月29日在Twitter上发布长文《My experience with Natronobacteriumgregoryi Argonaute》,最终得出了NgAgo并没有基因编辑的功能（But, now, the most importantmessage to convey is: NgAgo does not work for gene editing in mammalian cells.）。由于其数据没有公开发表，故以网络资料的形式附在文末作为补充（Fig.S7，来源：）。
8.
致谢
此文能成，感谢蝌蚪士各编委的鼎力支持及感谢胡绍凡同学的热心协助。
Fig.S5
Fig.S6
Fig.S7
9.
编后话
韩春雨面对科学质疑时表现出猥琐的拖字诀，答非所问，前后矛盾。因此，网友鉴于近期少部分不明真相的吃瓜群众，和大部分韩粉为韩被骂打抱不平，觉得怨特给为何骂韩的理由：
理由一: 先信誓旦旦有二十多家独立机构的实验结果支持他的论文。后改为六七家，再改一家，最近，，，，不提。最后，拉一国外诺维信公司合作垫背。
理由二: 作为通讯作者的韩拒绝直接回应各方质疑，声称自证清白是有病。
理由三: 没有任何调查，声称所有不能重复他实验的实验室都是因为细胞污染；并污蔑除韩以外无法重复韩实验的所有研究组的水准都低。
理由四: 未保留论文原始实验数据。理由是实验室穷。太奇葩，之前如果明确告诉自然，这个论文没有保留实验数据，直接就会被干掉。欠了三十万，买不起记录本，好搞笑。一个大型仪器一个记录本，很多学校可以免费领。呵呵，真该查查他的钱都花哪了，天天大保健他也受不了呀！
理由五: 声称停电，冰箱失去作用，细胞被毁了。韩大概以为只有他是学生物的。专业人士指出保存细胞用的是液氮成本又低又安全，停电也没事。河科大实验室看来也没那么穷。买不起保存实验记录的本本的话，韩大概撒完慌就给忘了。
理由六: 韩居然敢声称自然调查已经认可了他的实验。随后被打脸，改口称他自己没说过，是媒体造谣。媒体说有录音，韩教授韩教授即刻闭嘴不提。
理由七：什么2.0版本和撒马特版本，迟迟不出，这个是食言了！
总之，韩最近又提交什么新数据，估计跟九月份提交的差不多，均是没用的数据。通过韩以及这几个月的表演看：一是确认没有原始数据，二是根本没有人重复实验！这个“造假”胆子真大哈！如果主动认错撤稿意味着之前，骗到手的2.2亿经费就不好交差了。只好死撑，对最关键的问题避实就虚。抓住一切可能的救命稻草。然后打擦边球，这不，这次把诺维信搬出来糊弄不懂行的人。
最关键的是：即使NgAgo不剪切DNA, 那韩论文图4是怎么做出来的？
提醒大家，众所周知Ngago活结构需要在高浓度的金属离子下保持活性，实验时Mg离子浓度不能低。当时看到韩第一版protocol的时候看到要加 (大部分酶都要用EDTA保持活性，但NgAgo例外)时就在奇怪: 这家伙没学过无机化学和分析化学？EDTA是极强的金属离子螯合剂，这东西进去了, NgAgo的活性能高才怪，又加上NgAgo本身活性就不是太强的酶，而且酶活曲线随温度是指数变化的，韩的文章是在37到40度的区间达到高效，实际上NgAgo的最佳活性温度也是60度以上，怎们可能达到韩论文中的高效？为此，韩在网民学者的启发下，才明白自己的论文太假，赶紧发布实验不能加，还要加镁离子。其实，就让韩自己按其论文加个进去，他自己也承认不可重复其实验。因此，再多什么新证据，原论文也肯定是涉嫌造假，其真相到底是什么？
欢迎理性科学质疑讨论，推动中国科技进步发展！
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