“隔夜饭”可不香！成品细胞制剂冻存后活性下降低至36%，回输后被免疫系统加速清除
选自：间充质干细胞
作者：东海先生
前言 /
细胞疗法和再生医学产品拥有非常独特的产业链，在整个产业链上，细胞必须保持活力和功能。超低温保存已成为再生医学产品物流过程和供应链的重要组成部分。在培养液中运输的活细胞只有很短的保质期。保存方法不佳容易限制了使用间充质干细胞（MSC）治疗疾病的能力。
冻存降低MSC的活率与功能
MSC被使用之前，需要经过一系列的各种检测，从而保证了MSC注射液的安全性。MSC作为种子细胞或者工作细胞，进行超低温冻存，从而在时间上满足各种检测的需求。
不管MSC是作为种子细胞，还是直接制备成注射液的工作库的细胞，要超低温冻存MSC在-80度冰箱和液氮（液相/气相液氮罐）中，都需要用到含有冷冻保护剂（CPA）的冻存液。这些冷冻保护剂可以保护细胞免受冷冻和解冻这两个过程所带来的损伤。
MSC的应用，有2种常见的使用方式：
（1），使用培养新鲜的MSC制备成干细胞注射液；
（2），使用冻存的MSC直接制备成干细胞注射液。
早些年，美国的干细胞公司多采用第2种使用方式，目前已经意识到这种方式的弊端，而我国更多的是采用第1种使用方式。这两种使用方式各有优缺点。
从液氮罐取出的细胞
—
来源：公开资料
由于超低温保存，MSC细胞活率会受到一定程度的影响，基本上都出现细胞活率下降[1, 4-8]。有的研究团队采用的冻存方案（包括冷冻保护剂配方和冻存/复苏的操作）会导致MSC低至44%的活率[1]，这个44%的活率还不是最低的，还有更低的36%[5]。经过该冻存方案处理的MSC，出现临床治疗效果欠佳，大部分人没意识到是冻存方案出问题。当然，也有团队在处理MSC冻存降低活率方面做的比较好，经过冻存处理，MSC复苏后的活率可以均达到88%以上[8]。
直接采用液氮冻存的MSC，只是在临床应用前进行解冻复苏，然后直接给与MSC回输治疗，这样的操作会导致MSC出现免疫抑制功能的严重下降[1, 2]。另一团队也证实了MSC经过冻存后出现免疫抑制能力下降，即使细胞活率达到88%以上[8]。比较诡异的是，著名的卡罗琳斯卡大学医院的某干细胞团队，其MSC经过冻存后的活率也只有70%，但是却通过实验数据来证明“冻存”这个程序能提高MSC的免疫抑制能力[4]。
经过冻存解冻后立刻回输使用的MSC，更容易被体内的免疫细胞（T细胞）所杀伤，加速了机体免疫系统对输入的MSC的清除[9]。冻存不仅会影响到MSC的活率和免疫抑制功能，而且还会诱导MSC出现一定程度的细胞衰老[7, 8]。
一项系统性综述比较了来自41个独立研究的10个物种的骨髓MSC解冻后的评估报告，发现MSC的形态、免疫表型、分化和增殖潜力在很大程度上不受低温保存的影响，但27%的研究报告存活率显著降低[10]。因此，需要重视MSC的冻存对MSC应用疗效的影响。故，本文重点针对第2种使用方式做详细的介绍，让大家认识到第2种方式的致命缺陷，从而避免或者做出改良，进一步推动干细胞行业的发展。
解冻4小时内，人骨髓MSC的细胞存活率稍微下降，细胞凋亡率增加（最高可达30%），代谢活性和黏附能力降低；解冻后24h，人骨髓MSC的细胞活力恢复，细胞凋亡率下降，但代谢活性和黏附能力仍低于新鲜细胞[11]。冻存和解冻后的细胞受到各种类型的压力，导致细胞膜和细胞骨架发生变化[12]。有研究指出MSC解冻后黏附能力低，是因为MSC胞内的F肌动蛋白被破坏，而不是MSC细胞表面黏附分子脱落[13]。
有意思的是，在经历了冻存和解冻之后，三个不同供体来源的骨髓MSC细胞之间出现明显的生物学功能的差异，而这种变异可能与捐献者的年龄和种族有关[11]。有研究提出，24小时的恢复期可能会使MSC恢复到更好的功能状态[6, 11]。一般来说，MSC经过解冻复苏后进入传代培养阶段，MSC的增殖能力和功能特性得到完美的恢复[14-16]。
另外，在超低温保存中，细胞在低温等极端条件下会大量产生活性氧（ROS）[17]，ROS造成的损害可归因于脂质过氧化[18]、蛋白质氧化[19]和DNA损伤[20, 21]。抗氧化剂与冷冻保护剂联合使用可提高冷冻保存效率，但滥用抗氧化剂可能会产生不良结果[22]。
MSC的注射液的低温运输
MSC注射液的低温运输也是一个不可忽视的小问题，能影响到MSC在应用前的细胞活率。故而目前都建议MSC注射液（在人血清白蛋白的保护下）在24小时内使用[54]。人脂肪MSC在5°C的含海藻糖的保存液中24小时后，MSC的存活率可达95%[55]。人骨髓MSC含海藻糖的保存液中4度冷藏72小时后，MSC的存活率不到80%，但MSC的免疫抑制功能稍有下降[56]。MSC重悬在含40mM海藻糖的细胞保存液中，4度环境下，MSC在7天的存活率保持在90%以上[57]。
冻存的细胞，尤其是制备成注射液后的细胞，在运输过程中可能会经历各种应力，包括温度波动、机械振动和冲击以及压力变化。减少样品在运输过程中的可变性和保持稳定性，需要全面的运输考虑和制定经过验证的运输流程，即运输流程尽可能地在经历各种情况后不影响细胞的功能。
小结
理论上，MSC冻存在-196度的液氮里面（或气相液氮），细胞所有的生命活动都是处于静止状态，那么细胞的生命能永恒保存，只要不出现液氮补充不及时等情况。虽然冷冻保存程序可能会影响几个细胞过程，包括细胞存活、细胞功能、蛋白质表达、DNA完整性（表观遗传）、细胞骨架和核结构，但是相同的冻存方案对不同类型的细胞有不同程度和不同方面的差异化影响[64, 65]。
简而言之，活力和功能检测是确定解冻后细胞质量和提高当前冷冻保存方法效率的重要判断指标。细胞治疗行业的规范化发展，涉及细胞运输、细胞储存、细胞供应的可用性以及质量控制的时间。
欢迎评论区留言，留下您的观点。
也可扫描二维码，登陆细胞星球，与更多行业资源交流和链接