使用新型固定床生物反应器，开发高产量活病毒疫苗生产平台
摘要：病毒疫苗生产日益增加的重要性，推动了细胞高密度培养生产工艺的发展。传统的细胞贴壁培养工艺有一定的物理局限性，如较大的设备占地、时间和较多的劳动力。我们通过新型一次性scale-Xcarbo生物反应器建立的病毒疫苗生产系统，解决了这种限制。该单元结构紧凑，且可规模放大，并且可实现与生物感应器罐连接进行连续的下游纯化及浓缩工艺。Vero细胞是病毒疫苗生产中使用最多的贴壁细胞系之一。本文中使用Vero细胞专利细胞系进行含拉沙热病毒糖蛋白的活性重组水泡口炎病毒疫苗生产。本文中，进行了代谢物分析，并比较了传统摇瓶、细胞工厂以及scale-Xcarbo生物反应器的病毒产量。相比传统细胞培养瓶的2.67x10^6 pfu/cm2以及细胞工厂的5.77x10^8pfu/cm2，一次性使用生物反应器单位面积可生产高2-4 log的滴度，约为5x10^10 pfu/cm2。该新型生物反应器平台，可实现经济高效和可规模放大的病毒疫苗生产。
1. 简介
一次性使用的固定床生物反应器作为贴壁细胞培养平台，可用于多种不同病毒载体、活病毒及基于病毒的疫苗的生产。此类生物反应器将平底器皿系统的低剪切环境和自动化及可放大性相结合。Pall的iCELLis®和Eppendorf的Fibra-Cel®系统已被用于病毒载体和活病毒的高产量生产。使用这种封闭式固定床生物反应器具有显著的优势，包括产品控制、较低的资源和材料需求、节省生产时间以及更低的单位剂量生产成本。最近上市的固定床产品是来自Univercells的scale-X 生物反应器系统。scale-X产品线提供一系列的生长表面积规格：scale-X hydro（<3m2）、carbo（10-30m2）、以及nitro（200-600m2）。该范围可实现用于临床批次生产的可放大工艺和产能。在Univercells产品线中，生物反应器高度增加，而直径保持恒定。例如，carbo 10m2生物反应器高度为30m2生物反应器的1/3。而不同产品线之间的规模放大通过保持固定床高度恒定而增加直径来实现。例如，200m2生物反应器与10m2生物反应器具有相同的高度，但是直径不同。
scale-X carbo系统为一次性使用生物反应器，其偶联了以实验室规模自动化工艺控制器（pH、DO、T、搅拌、液体流速）操作的在线产物浓缩模块，可实现病毒产物的生产及同步浓缩；这是将这种固定床生物反应器与市面上其它产品区别开来的新特点。scale-X carbo生物反应器中的固定床可为细胞生长提供10至30m2的表面积（生长面积相当于120-360个滚甁、59-175个HYPERFlasks®、16-48个CellSTACK®-10层或6-16个HYPERStack®-36层罐），根据表面积规格，罐总体积为1.6-3.2L。这可有助于获得更高的单位体积细胞密度以及紧凑的占地，从而整合在标准的生物安全柜内。
大多数商品化固定床生物反应器使用随机装填的圆盘或织物条，作为细胞贴附的底物；而scale-X生物反应器使用以筛网层组织的固定床，其可为细胞生长提供所需均匀性以及罐与罐之间的一致性。固定床由5cm2宽度的刚性聚丙烯筛网条带和非编织亲水性聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）织物交替螺旋管式组成，前者用于结构定型和培养基流动，后者用于细胞截留和贴附。这可实现均质的径向和垂直细胞分布以及通过筛网层的线性培养基流动，确保均匀的营养物质供应。取样端口安装在生物反应器顶盖内，可通过手动操作，监测培养过程中的细胞生长。该功能为细胞计数样品获取提供了一个快速且便利的接入点，避免罐内的交叉污染风险。通过将受控的混合气体供应至生物反应器的顶部空间（氧气供应、CO2脱气），并允许通过下降膜液气界面吸收，实现环境控制，以支持细胞生长。
该生物反应器另一个与众不同的特点是在线中空纤维过滤器的使用，其可在生产阶段或收获时浓缩生产的产物。含有病毒的培养基灌流出生物反应器罐，进入专门的“收获”回流液容器中，而生物反应器内的培养基置换为新鲜的培养基。结果是可从生物反应器获得浓缩的小体积收获原液，从而简化下游操作，并降低其尺寸。在本研究中，我们在收获瓶前增加了在线澄清过滤器，以降低对中空纤维过滤器的污染。该系统可在单个标准尺寸的生物安全柜内进行所有上游工艺和初步的下游工艺。
由于scale-X carbo生物反应器舒适的人体工程学设计，我们选择该系统用于开发可放大的工艺，以生产基于重组水泡口炎病毒（rVSV）的拉沙病毒（LASV）疫苗。VSV是一种反义单链RNA病毒，可导致多种家畜的自限性疾病，且可感染人类，形成轻微的流感样综合征或保持无症状。VSV是一种有囊膜的子弹装病毒，粒径约70nm-200nm。较大的外源基因可包装进VSV并表达，使这种病毒成为理想的活病毒疫苗候选。此前，已经有报导构建了多种表达埃博拉病毒（EBOV）、马尔堡病毒（MARV）和LASV糖蛋白的载体。但是，用于生产物料所需的规模可能会是一个限制，特别是当使用贴壁细胞作为生产细胞时。在本报告中，我们证实了使用Univercells的scale-X生物反应器生产rVSV-LASV（VSVΔG/LASVGP）的工艺。与传统培养瓶生产工艺相比，使用scale-X carbo生物反应器生产获得的病毒产量可增加4-log。此外，实验检测了代谢物数据；谷氨酰胺、氨、葡萄糖和乳酸趋势均与病毒感染前生物反应器中的正常细胞生长一致。数据证实，相比传统的培养瓶生产，scale-Xcarbo生物反应器可获得更高的单位面积病毒产量，这将显著提升单次运行可生产的剂量数。总结来说，我们介绍了一种有能力在低环境足迹条件下，进行高产量病毒疫苗生产的新型可放大固定床生物反应器系统。
2. 材料和方法
2.1. 固定床生物反应器培养系统
所有实验使用10m2 scale-X Carbo生物反应器（Univercells，Brussels，Belgium）和在线切向流过滤（TFF）组件（图1）。生物反应器以1.0-2.0x10^4 cells/cm2的目标接种密度接种（按生厂商说明），细胞扩增阶段的工艺参数按生产商程序设置。培养参数确定为：温度35至37℃，pH 7.0至7.6，搅拌设置为250RPM，工作体积1.6L。外置的加热培养基循环回路连接至生物反应器，以支持高细胞密度。回路内的培养基体积足够大，以支持0.2-0.4mL/cm2的培养基与表面积比例。循环速度支持每天20-30个生物反应器体积。除基础补液管路为1/8”内径外，反应器上的管路尺寸大于1/4”内径。
2.2. 细胞扩增
Vero细胞系（Ology Bioservices Inc.）在专用无血清培养基（Ology Bioservices Inc.）中培养。细胞使用培养瓶和细胞工厂扩增，接种密度为1.0-1.5x10^4cells/mL。罐置于37℃、5%CO2环境培养。细胞传代，直到达到约1.0-2.0x10^9总活细胞量。收获时，细胞单层用1X DPBS缓冲液（Gibco，Waltham，MA）漂洗，以去除过量的耗竭培养基，之后使用TrypLECTS Select（Gibco，Waltham，MA）解离。离心去除TrypLE，细胞重悬于新鲜培养基。在Vi-CELL XR 细胞活性分析器（Beckman Coulter，Brea，California）上进行细胞计数。
2.3. 细胞密度和代谢物分析监测
插在固定床内的一次性使用采样条每日取出，使用裂解缓冲液和细胞核计数，确定细胞密度。采样条裂解5min，然后涡旋1min。细胞核用结晶紫染色，以观察完整的细胞核。通过从无菌采样端口提取培养基样品，使用BioProfile®FLEX2（Nova Biomedical，Waltham，MA）每日检测代谢物浓度。当离线检测偏离在线探针读数>±0.05pH单位时，执行pH偏移。
2.4. 感染过程
含有拉沙病毒（LASV）Josiah糖蛋白的重组水泡口炎病毒（rVSV）（去除糖蛋白G）（VSVΔG/LASVGP）由NIAID根据材料转移协议（LAB-18-P_LV-22仅用于体外使用，且仅用于培训和研究目的）慷慨提供。滴度为4.9x10^8 pfu/mL的VSVΔG/LASVGP原液用于所有生物反应器感染研究。接种后5天或达到峰细胞密度（以谷氨酰胺检测的氮源剥夺为准）后，使用病毒接种液进行生物反应器感染。简单来说，生物反应器排干耗竭的培养基，然后灌满含有病毒接种液的新鲜培养基。循环回路在感染时断开，以进行批量模式感染。每个运行以MOI 0.05的感染复数感染，感染过程进行48至72h。一旦采样条上的细胞计数耗尽，开始收获。培养瓶容器在与生物反应器相同的时间，使用相同的病毒感染接种液，进行感染。
图1. scale-X carbo生物反应器。scale-X carbo系统示意图，30m2生物反应器（红色）位于生物反应器控制台中央。5L收获瓶位于控制台右手侧，在线TFF组件位于收获瓶后方。位于控制台左手侧的是控制面板，允许用户启动或暂停生物反应器泵。此外，接种液和基础培养基瓶位于生物反应器左侧。在描述的实验中，使用10m2，即为30m2生物反应器的1/3。外置循环回路未显示。
2.5. 病毒收获
收获原液通过由Sartopure PP38μm过滤器和Sartopore 2 0.8/0.45μm过滤器组成的两步深层过滤器链，收集进入二级容器。在运行4中，罐初步清空后，生物反应器用额外的1L新鲜培养基润洗，以冲洗掉固定床中所有残料的病毒颗粒。该冲洗液通过深层过滤器，以TFF步骤，进行病毒浓缩。收获原液使用100kD中空纤维TFF组件浓缩2倍。培养瓶容器在与生物反应器相同的时间内进行收获，收获原液以1000g离心10min澄清。
图2. Carbo生物反应器示意图。突出显示了以编织筛网基质围绕的双层非编织筛网（蓝色）。此外，显示液流方向，以指示培养基在整个生物反应器内的流动。用于在线pH和DO监测的探针位于生物反应器中央。
2.6. 噬斑分析
收获原液取样，以Ology Bioservices,INC.优化的方法，通过噬斑分析定量，检测病毒滴度。简单来说，先生成10倍连续稀释液，用结晶紫染色15min，漂洗，噬斑计数。
3. 结果
3.1. Scale-X carbo系统中的Vero细胞生长
Scale-X carbo系统的独特设计可允许液体在固定床内流动，并通过内部集中通道回流到叶轮，形成连续的降膜机制（图2）。降膜机制可在生物反应器的覆盖层内实现气体交换。使用生产商提供的指南和工艺参数，进行了工艺建立运行（运行1）。该运行确定Vero细胞系可在10m2固定床生物反应器内生长至一致的细胞密度（表1）。随后的运行设计用于建立不同的操作条件，以达到最佳细胞密度（图3）。如图4所示，在所有的运行中，从细胞接种（第0天）后的第1到5天，可观察到均匀的细胞生长。在运行3中，允许细胞多生长1天，以确定多出的1天是否可导致细胞显著的生长。结论是，等到第6天感染不会形成更高的细胞密度而获得最大化的病毒生产。所以，推断最佳细胞生长发生在接种后第5天，即第5天可进行Vero细胞病毒感染，以触发进一步的病毒生产。
3.2. 代谢物趋势
在细胞生长阶段，检测了主要代谢物的活性，包括谷氨酰胺和葡萄糖的消耗以及随后的氨和乳酸的生产（图4）。细胞接种时的谷氨酰胺浓度为2.4±0.2 mmol/L，并被消耗至低于分析的线性范围。同样的，接种时的葡萄糖浓度为17.57±1.27 mmol/L，并被消耗至低于分析的线性范围。最高乳酸生产值为16.71mmol/L，最高氨离子浓度为2.77 mmol/L。
3.3. VSVΔG/LASVGP的生产
在第一个病毒生产运行中（运行1），接种后第5天，以MOI 0.05感染复数感染VSVΔG/LASVGP。感染后，可在生物反应器内的上清液中观察到显著的细胞碎片，感染后第2天，开始病毒收获。生物反应器排液，以收获含有病毒的上清液，进行培养基润洗步骤，以从滞留体积中冲洗出所有残留的病毒。VSVΔG/LASVGP收获完成后，使用标准噬斑分析检测病毒滴度。滴度计算为4.25x10^12 pfu/mL，对应的总滴度为单次运行6.80x10^15pfu，标准化滴度为6.80x10^10pfu/cm2（表2）。
图3. 各个生物反应器运行的细胞生长趋势。所示细胞计数至生物反应器感染时间点。不同的运行标注如下：运行1（▲）、运行2（t）、运行3（t）以及运行4（l）。
图4. 各个运行中，10L carbo生物反应器内Vero细胞生长的代谢物浓度趋势。分析感染前，与细胞生长相关的代谢物，谷氨酰胺（A）、氨（B）、葡萄糖（C）以及乳酸（D）。不同的运行标注如下：运行1（▲）、运行2（t）、运行3（t）以及运行4（l）。
运行2和3的部分病毒生产参数与运行1不同。首先，病毒收获在感染后第3天开始，其次，收获原液通过2-步深层过滤链过滤，以去除过量的细胞碎片，然后收集到回流罐中。深层过滤器收获后，有极少量的病毒被截留（数据未显示），2个运行的总体病毒产量与运行1接近。运行2和3原液中的平均病毒滴度分别为5.03x10^12 pfu/mL和2.90x10^12 pfu/mL，对应的膜表面积标准化收获滴度为7.55x10^10 pfu/cm2和4.35x10^10 pfu/cm2。两个运行以及前三个运行之间，计算滴度无统计学差异。
图5. 在线纯化策略示意图。Scale-X carbo生物反应器连接至在线TFF组件和收获容器。某些情况中，在收获瓶前的生物反应器流出管路上增加深层过滤器（未显示），作为下游工艺部件。
最后一个运行（运行#4）使用在线切向流过滤（TFF）步骤，以在原液收获并以深层过滤器澄清后，进行病毒浓缩。在线TFF、生物反应器以及回流容器的示意图如图5所示。所有细胞接种和感染参数按运行2和3中执行的程序进行。但是，病毒原液收集后，上清液物料使用TFF进行浓缩。TFF工艺在之前的运行中没有进行。TFF步骤的加入可实现对生物反应器进行额外的漂洗，以收集可能位于生物反应器固定床中的所有残留病毒。病毒收获液从1.6L浓缩至750mL，收获原液的滴度计算为1.03x10^12pfu/mL（表2）。TFF浓缩步骤完成后，回流液的滴度检测为2.47x10^12pfu/mL（表2）。该滴度对应为浓缩2X，多出的病毒可能是漂洗后从固定床回收的病毒，也可能与噬斑分析本身的差异性有关。
最后，当与使用T-225培养瓶或CELLSTACK-10进行的生产进行比较时，可发现使用scale-X生物反应器可显著提高病毒生产的量。每mL可增加超4 log对数的病毒，且与每个独立生物反应器运行相关的参数无关，对比CELLSTACK-10和T-255生产，这相当于单个生物反应器可增加4-7 log对数的病毒。总体来看，scale-X carbo运行的结果证实了使用这种生物反应器是进行活病毒生产、澄清和浓缩的有效方法。
4. 讨论
一次性使用技术仍是生物制品生产的金标准，而其可放大性限制了贴壁细胞固定床生物反应器系统的使用。scale-X生物反应器产品线可从2.4m2台式系统放大至600m2商品化规模系统。scale-X carbo生物反应器已被证实是可克服其它固定床生物反应器系统可放大性局限的有用工具。类似的系统没有中间性表面积规模选择，如10m2或30m2。而该规模可为多种应用提供所需物料，如临床前毒理学研究批次、下游方法和分析方法的开发、生产对照物料以及临床I期研究。其它固定床生物反应器系统的一个限制是，当放大到更大规模的固定床直径时，产率会降低。scale-X carbo系列规模放大时增加固定床高度，而保持直径恒定，从而降低了规模放大过程的影响。此外，此类生物反应器的另一个与其它固定床生物反应器相区别的独特之处是固定床的基质。固定床由5 cm2宽的非编织PET织物和聚丙烯筛网交替螺旋缠绕管式组成。PET织物提供用于细胞贴附和生长的三维微环境；聚丙烯筛网提供结构和液流通道。固定床的螺旋设计结合生物反应器高度的增加可实现生物反应器内均匀的径向和垂直细胞分布，这可通过插入到固定床内的PET织物采样条进行监测，采样条可通过生物反应器系统顶盖内的取样端口进行采集PET样条。八个取样端口围绕顶盖均匀分布，其特征是具有一个锁定端口系统，系统包括一个磁性连接至塑料杆的螺帽，而塑料杆连接至PET条。螺帽和塑料杆系统可从生物反应器简单地取出，杆和帽的磁性可方便地将杆从帽上取下，并更换螺帽后放回端口，而维持无菌操作。然后可从杆上取下采样条，PET条裂解细胞并细胞核计数后，用于确定单位面积的细胞数。取样端口的位置和PET条在整个固定床内的分布可用于确定细胞密度和分布。
此外，PET-聚丙烯筛网螺旋技术由于通过螺旋固定床聚丙烯筛网的培养基液流模式，可实现均匀的营养物供应（图2）。培养基循环流速设置可达到每天约25个培养基体积置换。置换用于提供新鲜的营养物质，并在毒性代谢物积聚前将其去除，结果表明，在生物反应器内的细胞扩增阶段，可获得一致的细胞生长。如果细胞的代谢要求需要增加循环，可进行更高的置换。
最后，该生物反应器包括一个在线TFF中空纤维系统，可通过连续且无菌的方式，进行病毒产物的纯化和浓缩。为了缓和收获过程中，生物反应器液流中细胞碎片导致的中空纤维系统污染，可在流出生物反应器的管路系统上焊接深层过滤器链，进行澄清。这可在在线纯化过程中，实现额外的澄清步骤，并捕获细胞碎片。当在生物反应器内增殖可裂解细胞的病毒并通过在线TFF系统纯化病毒产物时，这是必不可少的。
本次研究的目的，首先是确定Vero细胞系在结合至生物反应器PET织物床后是否可增殖，其次是比较在生物反应器与传统培养瓶中进行的病毒疫苗首选物生产的结果。当将细胞计数按相等表面积进行标准化处理后，生物反应器内的细胞密度高于T-225培养瓶或CellSTACK-10容器内观察到的最高细胞密度。这意味着，仅从更高的单位面积细胞数量，即可推测其可获得更高的病毒产量，这还没有考虑可能获得更高病毒生产的细胞整体适应性因素。此外，在生物反应器内生长的细胞代谢物趋势在4个运行中保持一致，这表明了整体的细胞适应性。对于病毒生产，由于使用的体积不一样，很难根据容器和生物反应器的体积来比较滴度。例如，T-225培养瓶的收获体积约为60-65mL，CellSTACK-10和scale-X的收获体积分别约为1.5L和1.8L。如表2所示，除了总收获量外，滴度按单位体积报告。但是，为对生产进行标准化比较，滴度按单位面积报告。这可对不同容器和生物反应器内的病毒生产进行更加全面的比较。平均来说，T-225产量为2.67x10^6pfu/cm2，而CellSTACK-10产量约为5.77x10^8 pfu/cm2。4个独立scale-Xcarbo运行的平均滴度约为5.09x10^10 pfu/cm2。按表面积进行标准化处理后，相比CellSTACK-10，scale-X carbo生物反应器病毒产量约增加了2 log，而相比T-225，增加了4 log病毒。此外，scale-X carbo生产获得的高滴度是使用约1.6L的小体积培养基获得的。更小的体积可降低下游工艺中与澄清、纯化和浓缩相关的复杂性。增加用于澄清的深层过滤器以及用于纯化和浓缩的在线TFF，可实现连续的无菌下游工艺，并将病毒产物收集在回流容器中。下游纯化工艺通常会导致一定程度的病毒产物损失，但是，使用在线TFF中空纤维浓缩系统没有导致病毒产物的损失。这可能是由于收获过程中对生物反应器进行了冲洗，从而回收了可能截留在固定床基质中的残留病毒，也可能是因为增加了用于细胞碎片澄清的深层过滤器以及过滤器孔径的正确选择。在线TFF可在病毒收获后进行漂洗步骤，以收集残留的病毒，且由于TFF可实现2-3X的浓缩，所以抵消了漂洗增加的体积。最后，由于不同病毒的粒径不同，所以需要根据粒径来选择正确的过滤器，以避免纯化过程中，由于过滤器而导致的病毒损失。
综上所述，病毒疫苗生产的增加可能源于多方面的因素，但主要是单位面积细胞数的增加以及细胞的整体适应性，这可能是由于PET纤维床的几何结构实现了细胞密度均一性、捕获以及贴附性。最终，这些因素实现了在培养基流动通过固定床聚丙烯筛网层时均匀的营养物供应。该系统解决了疫苗低成本、高产量生产的关键需求，标志着向活病毒疫苗的大规模生产又迈进了一步。最后，单位面积滴度的增加可提高单次运行可生产的剂量数。
原文翻译：D.M.Berrie, R.C.Waters, C.Montoya, et al., Development of a high-yield live-virus vaccine production platform using a novel fixed-bed bioreactor. Vaccine, 2020, 38:3639-3654.
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