将病毒载体生产从塑料器皿向固定床生物反应器转变
将病毒载体生产从塑料器皿向固定床生物反应器转变
来自Univercells的概念验证研究 – 可放大的HEK293细胞生长和腺病毒生产
早期到晚期临床开发中的基因和修饰细胞治疗（例如，嵌合抗原受体[CAR] T-细胞治疗）在多种疾病的治疗以及潜在治愈方面显示出了良好的前景。这类新一代药物中的多个产品已经获得了审批并开始进入市场。
尽管有大量候选药物的管线开始进入临床试验阶段，但其仍面临着可能的生产瓶颈 – 病毒载体生产 – 其可能延迟产品的商业化进程。
与使用悬浮细胞培养的大多数基于工程蛋白质的生物制品不同的是，病毒载体的生产需要使用以基质作为支持的贴壁细胞。目前，有两种选择可用于贴壁细胞生长：使用微载体或多层静态式塑料器皿。
微载体悬浮在罐内，并通过搅拌提供一个均质的环境。但是，对于用于病毒载体生产的剪切敏感型细胞来说，搅拌会是一个极具挑战的过程。由于反应器内流体动力学状态的变化，工艺规模放大也需要较多的工作。此外，这种工艺很难达到高细胞密度，而且规模放大需要使用大量昂贵的转染试剂。
出于这些原因，传统上会使用静态的塑料器皿，进行贴壁细胞的生长、转染以及腺病毒载体的生产。但是，这种方法也有一定的局限性。首先，其不能实现精确的环境控制（pH、溶氧[DO]、培养基组成），需要大量的人工干预操作。此外，规模放大也很难实现，只能进行规模扩展。
一种可规模放大的解决方案
Univercells提供的可规模放大且自动化的一次性使用固定床生物反应器可解决这些技术难题，为制药厂商提供了一个以可负担的方式向市场提供所需数量产品的机会。生物反应器的示意图如图1所示。
由螺旋卷式的非编织聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）织物层组成的紧密填充的支撑基质，可在小体积生物反应器内实现高细胞密度。位于生物反应器内的磁性离心叶轮具有两种功能：良好的混匀，以确保营养物质在整个固定床内均匀的分布，以及通过在罐顶部空间形成“降膜”，以增加气体交换的表面积，从而进行通气。培养基在细胞间温和循环，提供类似于静态塑料器皿中的条件，并保证在垂直和水平方向上均具有均匀的环境。
系统包括自动pH、DO以及温度控制；自动接种及手动培养基和细胞取样；以及通过循环回路进一步添加培养基的泵。
规模缩放通过增加固定直径的高度（~10-、20-以及30-cm固定床高度）、然后平行增加直径（10、20以及30cm）来实现。由于流动通过固定床的液体培养基的线性流速在所有规模条件下保持恒定，所以细胞处于相似的低剪切状态。系统的自动化功能和简单的规模放大可实现病毒载体更快速的开发和商品化。
工艺转换研究
通过使用相同的接种密度以及培养基比例体积，比较了在scale-X hydro 生物反应器系统和标准塑料细胞培养瓶中进行的工艺的性能，以研究将病毒载体生产从静态塑料器皿转换至固定床生物反应器的简单性。
在scale-X hydro系统中进行的细胞培养工艺包括5个步骤：（1）生物反应器准备，（2）接种和细胞黏附，（3）细胞扩增，（4）病毒感染以及（5）收获（图2）。
实验使用来自冻存细胞库（Momotaro-Gene）的HEK293细胞。接种液在标准条件下，在细胞培养瓶中制备。工艺过程中，监测细胞密度和病毒滴度（使用光学显微镜进行目检计数）和代谢物（葡萄糖、乳糖）浓度（离线代谢物分析仪）。
在所有工艺中，细胞扩增时连接一个外部的培养基源，接种后不久，开始通过生物反应器进行循环（图2）。在第一个生物反应器中（#1），培养基在第3天置换，以使细胞进一步生长，但细胞不进行感染。在生物反应器#2和#3中，细胞扩增以批次模式分别进行2和3天，然后细胞感染。尽管细胞在感染后，会自然裂解，但仍使用去垢剂，以提高产物收率。
成功的细胞生长和感染
在相同条件下，固定床生物反应器（#2和#3）中的细胞生长高于标准塑料器皿。（结果如图3所示。）从图中可见，固定床生物怒反应器在第3天（2.1 x 10^5 vs. 1.3 x 10^5 cells/cm2）和第6天(6.5 x 10^5 vs. 3.2 x 10^5cells/cm2) 的性能优于标准塑料器皿。注意，塑料器皿和生物反应器使用相同的培养基置换比例，以在第6天达到高细胞密度。
所有生物反应器均在接种后，使用4.2L 外置培养基循环回路进行操作。在第3天，生物反应器#1的外置培养基循环回路更换为新鲜培养基，从而使细胞进一步生长至第6天。生物反应器#2和#3以批次模式进行操作，然后感染（分别在第2天和第3天进行）。感染后细胞密度未显示。生物反应器#2的对照细胞密度未提供。
感染在达到目标细胞密度条件时（生物反应器#2和#3分别在第2天和第3天）进行，观察到所有细胞在感染后第3天裂解。使用相同的去垢剂处理，收获每个工艺的产物。由于未进行任何的工艺开发工作，所有生物反应器内的病毒滴度约比对照塑料器皿低1 log IRU。
通过工艺优化进一步提升的潜力
研究证实，基于静态塑料器皿的产基因治疗用腺病毒的HEK293工艺可成功转换至Univercells scale-X生物反应器系统。系统在小体积生物反应器内达到极高细胞密度和良好病毒产量的潜力，突出了系统实现高水平生产的能力，且设备占地大大降低，同时可实现自动化工艺步骤。
值得注意的是，在静态塑料器皿和固定床生物反应器内进行的工艺获得了相似的结果，而生物反应器内进行的工艺并未经过太多的优化工作。Scale-X hydro 生物反应器内获得的更高的细胞密度很好的反映了系统内更好的环境控制（pH和DO），这有利于实现稳定的生产环境。结合非常有潜力的病毒产量结果，更高的细胞密度为进一步的工艺开发打开了大门。
未来的工作将集中于关键工艺参数（CPC）的确定，以优化生物反应器内的细胞培养条件，这在传统静态工艺中是无法实现的，因其缺乏工艺参数的控制，如pH和DO。
Scale-X™ hydro 系统是生物反应器产品线的一部分，该产品线可用于生物工艺开发和中试规模培养（scale-X™ hydro 2.4 m2 和carbo 10-30 m2）、中到大规模工业化生产（scale-X™ nitro， 200-600m2，一般适用于疫苗生产）以及更大规模工业化生产（scale-X™ oxo， >2000m2，满足基因治疗需求）。已经计划了进一步的实验，以证实工艺向这些更大规模生物反应器的可放大性。
原文翻译：Y.Dohogne, F.Collignon, J,Drugmand, et al., Transferring Viral Vector Production from Plasticware to a Fixed-Bed Bioreactor. Genetic Engineering & Biotechnology News, 2019, 39 (2): 60-62.
摘要：生物治疗行业正在经历一段令人振奋的发展时期，越来越多针对此前未能满足的适应症的基因治疗方案开始进行临床试验阶段。但是，目前基因治疗产品的全球可用性和可负担性受到与其生产相关的挑战。使用传统技术生产病毒载体会面临多方面的限制，比如使用基于培养瓶的细胞培养时的可放大性限制以及较高的产物生产成本，或者使用传统固定床生物反应器时，较低的产率以及可重复性。为了克服这些阻碍，生产技术必需重新设计，以简化规模放大过程，并降低产品成本。Univercells开发了NevoLine™平台，这是用于高通量、低成本病毒载体生产的全自动化、低占地的灵活解决方案。该平台利用了工艺强化的概念，实现“端到端”药物底物生产所需的所有单元操作的自动化和链接，并整合到低占地的模块当中。模块中的工艺序列从高细胞密度结构化固定床scale-X™生物反应器中的细胞培养和病毒生产开始，同时，生物反应器链接至用于连续病毒收获和体积较低的在线浓缩回路。病毒生产之后进行在线连续澄清和纯化。本讲座将以用于rAAV和腺病毒生产的HEK293细胞为例，介绍上述技术原理在病毒载体生产工艺中的成功应用。案例研究将介绍结构化高密度固定床生物反应器的使用如何显著提高细胞密度、病毒滴度和均质性。此外，案例研究也将介绍我们平台的创新设计如何克服操作和经济障碍，使所有有需要的人可获得且可负担基因治疗产品。
“从可放大性考虑，我个人认为，scale-X在现阶段有非常大的优势，scale-X系统提供三种不同规模，相比iCELLis，可支持更大的操作范围。Univercells提供适用于研究的scale-X，其表面积为2.4m2，与表面积最高2.4m2的iCELLis Nano相似。然后是中等规模的生物反应器，scale-X carbo，表面积范围为10 - 30m2，对于工艺开发项目来说，是非常出色的选择，已可生产足够临床1期和2期使用的产物。之后，工艺可线性转换至最大的规模，表面积200 - 600m2。而对于iCELLis来说，4m2和500m2系统之间，有很大的空白空间，对于有些项目来说，这个跨越太大了。”
—— Pim Velthof, Process Scientist,
Upstream Bioprocessing, Batavia Bioscience.
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