连续生物工艺：承诺与挑战

生物生产通常以批次工艺进行，特别是下游工艺（DSP）操作。不断提升的发酵滴度、更低的操作规模以及旨在提高产物质量的努力，都在推动对开发连续生物工艺的兴趣。在未来10年内，所有开发的药物中，将有一半为生物药，所以，值得开发更加高效的工艺。

连续工艺定义为整合的（物理性连接的）、连续单元操作，操作没有或者只有极低的储存体积。变更为连续工艺可降低传统单元操作的尺寸，从而可实现相同“空间-时间”产量的低成本投入。目前，约有90%的生物产品使用批次和补料分批培养生产（即上游工艺，USP）以及批次式DSP操作。用于连续工艺的平台开发显示，这种技术正在走向成熟。工业界和学术界的研究人员都在研究使用连续系统进行生物药生产的潜力。

在过去10年间，USP中的空间-时间产量已经提升了将近100倍。这得益于多方面的因素，包括更加优化的表达系统、基因工程细胞系以及优化的培养基和更好的生物工艺控制。与此相对的是，DSP的发展却相对较少。所以，现在行业关注的焦点已经转移到如何提升生物生产的这一阶段。与USP不同的是，DSP的成本会随进样料液的体积而线性增加，目前，DSP的成本约占总生产成本的80%。生物制药从业人员在降低生产成本、同时需保持产物质量方面面临着巨大的挑战。传统而保守的生物制药环境需要颠覆性的、改变游戏规则的技术。

在2011年至2016年间，美国FDA批准了多个蛋白质治疗药物。其中，约有50%为单克隆抗体（mAb），而凝血因子和酶分别占19%和11%。血浆蛋白、融合蛋白、生长因子和激素总共占22%。这里，文章将关注不同药物产品的生物工艺，包括mAb、酶、凝血因子、腺病毒和慢病毒、以及RNA/DNA-修饰产物。文章将突出介绍目前的趋势、技术、挑战以及对连续生物工艺的展望，并重点关注一次性使用技术（SUT）对连续生物工艺的影响。

赋能技术和单元操作

相比传统批次和补料分批工艺，完全整合的连续生物工艺可提供多方面的优势，包括低滞留和低循环时间；更低的设备尺寸；以及更低的水、能源消耗及原材料使用。这些优势可降低固定资产投入和运营成本。但是，连续生物工艺需要对工艺具有深度的了解，且需要采用工艺分析技术（PAT）。生物生产人员还需解决批次定义、操作超规格（OoS）物料以及相关的监管问题。本章将介绍可按连续模式操作的单元操作。

细胞培养：灌流系统已良好建立，且已被大型生物制药厂商了解并采用，如Genzyme、Bayer、Janssen、BioMarin、Shire、Merck Serono、Novartis以及Pfizer。灌流生物反应器可实现不稳定蛋白质的连续收获，以使产物降解最小化。美国FDA已经批准了约20种使用灌流系统生产的生物药。此类系统可放大至4,000L规模，且可连续操作达60天以上。工艺的总体维持时间主要取决于分子的基因稳定性，这需要投入大量的研究。

收获/初步回收：尽管工业微生物发酵通常会使用连续过滤设备（如带式或鼓式过滤器），但是这些技术没被用于细胞培养。交替式切向流过滤（ATF，Repligen）可用于细胞截留，是目前最受欢迎的细胞初步澄清单元操作，特别是在灌流系统中。1台ATF设备可连续操作达2,000L培养体积。也有其它的单元操作被研究并应用于工艺行业（如连续离心、超声分离、水两相分离以及膜吸附）。这些技术的采用对于已有的生物产品来说可能会有一定难度，但是对于生物工艺开发人员在设计未来的真正连续工艺时，却非常有吸引力。下表列出了DSP中常用的单元操作及其是否可提供一次性使用单元。

连续水两相萃取（ATPE）工艺已经被用于从细胞培养中纯化抗体，其基于聚乙二醇（PEG）/磷酸提取以及随后的漂洗操作。该方法是传统层析工艺非常有吸引力的替代方法，因其可连续操作、可放大且具有良好的经济效益。在DSP中，ATPE单元操作可整合作为连续产物捕获步骤。尽管这种技术已有使用案例，但其仍处于生物产品的早期开发阶段。对一些问题（如了解分区机制）的克服，将促进该技术的规模放大。

膜吸附：层析填料的动态载量通常会形成蛋白质纯化的瓶颈。为配合更高的生物反应器产量，层析柱的尺寸通常会过大。在捕获和精制步骤中，膜吸附可作为传统层析工艺的替代方法。表面功能化的膜可提供高纯化产量。产品包括Sartorius的Sartobind Q、Pall的Mustang Q、EMDMillipore/Natrix Technology的NatrixHD-A以及Natrix HD-Sb膜。这些膜吸附产品经验证，可用于以流穿模式（反向层析）去除杂质，结合DNA、残留蛋白质、宿主细胞蛋白质（HCP）、内毒素、病毒和聚体。膜吸附通常为可抛弃型产品，且为SUT。

连续病毒灭活：基于哺乳动物细胞表达的生物工艺通常需要至少两个独立的步骤，用于外源性病毒的去除。这些步骤可包括低pH处理、溶剂/去污剂处理以及纳滤或UV处理。方法的选择及其顺序取决于药物产品特性。所有步骤必需验证，且处理参数，如时间、温度、压力、流速等需受控。传统上，低pH病毒灭活一般作为批次工艺进行。但是现在，研究人员已经开发了一种在涡旋流逆变器（CFI）组件中进行连续病毒灭活的系统。该组件可实现层流模式下的活塞液流行为。这种连续低-pH（pH<4）病毒灭活技术以一次性使用单元构建。

对于未来的生物工艺来说，开发替代性病毒灭活技术至关重要，特别是考虑到目前使用的某些溶剂在不远的将来将被禁用（如UnionCarbide Co.的Triton品牌）。Bayer Technology Services开发了一种缠绕UV辐照源（254nm）的紧凑管状反应器组件。该系统可实现有效的混合，并使病毒最大限度地暴露于UV光，但其在中试和商品化规模连续工艺中的使用尚未被证实，且其可能破坏蛋白质。除病毒过滤仍是一种精细的工艺，需要严格地控制恒定流速以及压力和温度条件，这使其在连续工艺中的整合极具挑战性。

层析：模拟移动床（SMB）层析是一种已经良好建立的连续纯化系统，其已被用于分离小分子（如果糖和葡萄糖）。SMB层析也可用于连续纯化，其最近的一些进展已使其可用于生物工艺，包括与上游操作相整合。但是对于此类工艺，还需要深入的了解，以确定其与其它系统整合时的相容性。

离心：离心技术在初步澄清中扮演了重要的角色。该技术最近的发展在降低细胞破坏和产物损失方面已经获得了非常有前景的结果。例如，kSep和UniFuge系统是无需在线清洗/蒸汽灭菌（CIP/SIP）的一次性使用技术，这为向连续工艺的发展扫清了障碍。

超滤（UF）和洗滤（DF）切向流过滤：UFDF操作几乎是所有生物制药DSP的组成部分。在朝连续工艺方向改造UFDF技术的过程中，单通过TFF（SPTFF）是一种用于蛋白质连续浓缩的新兴概念，但是，对工艺控制的定制化（不同类型和膜面积）、PAT需求以及客户要求使这种技术的执行非常困难且进展缓慢。

沉淀：连续沉淀技术是一种简单、稳健且经济上可行的方法，其可用于从澄清的细胞培养上清液中去除工艺相关杂质。尽管沉淀技术已用于血浆分馏（非连续模式），但在生物制药行业却较少使用。不过，作为一种新兴技术，已有研究显示，通过使用新型反应器组件，如涡旋流逆变器（CFIR），沉淀可整合到连续生物工艺当中来。

一次性使用技术的角色

一次性使用技术使用的不断增加是连续生物工艺的驱动力之一。但是，由于大多数一次性使用技术可放大性有限（如大多数供应商的一次性使用生物反应器最大为2000L），这就需要替代性方法，以提高空间-时间产量，并降低操作成本（OpEx）。

从细胞培养前系统到药物底物冻存，大多数单元操作都已有商品化的一次性使用技术可用。目前，已经开发有一次性使用探针和传感器，并证实可用于连续生物工艺，以降低CIP需求。使用即插即用的系统，有可能构建仅使用一次性使用技术的连续生产生物工艺。

SUT系统通常所需的资本投入（CapEx）更低，但是OpEx会增加。对于大部分的上游部件，已有SUT产品，可实现连续操作。但目前，不是所有的DSP部件有一次性使用形式。

一次性使用传感器已在GMP环境中被广为接受。此类设备可简单地整合到连续生物工艺中来。但是，一次性使用探针也有其局限性。此类设备在长时间使用中的耐用性和功能完整性需良好鉴定。但是，此类传感器的值通常只作为趋势监测，用于批次记录的值会在质量控制（QC）实验室中，通过检测工艺内控制（IPC）样品进行确定。

工艺配置的可能性

图1所示为用于连续工艺执行的不同工艺配置和可能性。由批次和连续操作组成的工艺称为半连续或混合方法。案例研究证实，有可能连接连续上游和下游系统，获得端到端的整合式工艺。对于组成性表达的抗体或其它生物药的细胞培养工艺来说，这是可能的。但是诱导性生产或二级代谢物的生产则没有那么适合连续工艺，其发酵通常为批次或补料分批操作，在结束时，快速处理整个体积。

连续USP和批次DSP：图1所示为连续USP连接至批次DSP。此类混合系统已经被用于生产复杂/不稳定的蛋白质，如酶、血液因子以及mAb。

批次USP和连续DSP：对于此类工艺，传统补料分批模式与连续操作的DSP相结合。使用这种方法的主要驱动力是在过去十年间，上游操作可获得的表达水平和产物浓度（5-10g/L）的显著提升。为应对此类提升，生物药生产商开始评估连续DSP操作。此外，当将批次操作转变为连续下游模式时，操作成本可降低达70%。

连续层析在产物捕获和精制中扮演着核心角色。目前，行业内已经开发了很多连续层析mAb工艺，并已有用于实验室和中试规模应用的商品化产品（表2）。连续蛋白质纯化会有一定的局限性（如不能在生物负载要求严格的环境中进行长时间的操作）。要将这种方法用于商品化规模操作还存在一定的挑战。当多个生物反应器物料进入一个DSP系统或者延长的下游工艺时间不利于蛋白质纯化时，此类混合系统的操作会较为困难。

连续USP和DSP：为实现连续工艺的全部潜力，完整的系统应以端到端的连续模式进行操作。这也是许多生物制药公司的目标。表1和2所示为目前在标准mAb DSP工艺中可以连续操作的大部分单元操作。但不是所有单元操作目前都已达到商品化生产规模。已有关于在研发规模下，完全整合式连续生物工艺的报道。最大的挑战是整合USP和DSP，因为连续操作DSP相当困难。但是，部分连续的操作还是有可能带来高风险，这取决于工厂的设计。这样一套系统对于单产品工厂来说，可能可以满足需求，但是对于多产品工厂，其可能使用多个尺寸不一的一次性使用生物反应器，如其料液进入一个连续DSP链，则灵活性会大打折扣，可能需要建立多个DSP链。

连续工艺在生物制药中的现状

目前，FDA已经批准了3个使用连续生产工艺的产品：Vertex的囊性纤维化药物Orkambi（lumacaftor和ivacaftor联合）、杨森的Prezista（达鲁纳韦）以及礼来的Verzenio（abemaciclib）。FDA鼓励生物制药行业朝连续生物工艺方向发展。

大部分的报道为中试和实验室规模的连续操作，而关于工业规模生物药生产的报道不多。Sanofi-Genzyme、Merck以及Bayer已经证实了实验室和中试规模的先进工艺案例。Sanofi-Genzyme报道了用于重组mAb的端到端连续生产方法。工艺组成包括使用ATF（Repligen）的上游灌流生物反应器（12L）以及下游的周期性逆流层析（PCC）。系统可达到8g/day的产量，总体收率为80%，且产物质量在30天内保持一致。

另一个案例是Merck对整合式生物工艺概念的证实，即使用一次性使用系统的“蛋白质提炼操作实验室”（PROlab）。该工厂上游有10L灌流生物反应器。一次性使用TFF和SMB层析整合作为下游核心单元操作。整个工艺使用整合的分析系统进行控制。该先进概念可获得10g/day的产量。

Bayer Technology Services开发了连续且可抛弃型的“未来生物工厂”平台。上游使用灌流生物反应器。对于下游产物精制，混合模式和阴离子交换层析连接至BioSMB平台。使用该系统，生产商达到了22.7g/day的产量。大部分DSP单元操作使用一次性使用技术，并使用Siemens控制系统，以实现工艺自动化。该DSP操作仅需2.5天，而USP操作为28天。

延长DSP操作持续时间仍需要不少工作。尽管已有成功案例，生物制药生产商在商品化规模连续生产的采用方面，进展仍然较慢。但是，乐观地看，也可以说成长进程非常稳定。

连续生物工艺的未来

生物制药行业通常被认为是一个相对保守的行业，因为从全球来看，这是受监管最多的一个市场。开发并推出一个新药可能需要数十亿美元。更改一个已经注册的生产工艺（如更改生产技术）非常困难且昂贵，因为需要新的临床试验和审批。但是，引入一个新产品为新技术的使用提供了可能性，例如连续工艺。此类技术在生物制药行业中的采用尽管进展缓慢，但很稳健。连续工艺需要对技术、R&D和法规有广泛而深入的了解。

技术：新工艺技术的采用应在工艺早期和药物开发中就进行考虑。技术、药物产品和法规应协同发展。许多R&D问题也应在新技术采用前解决。例如，细胞系在长时间连续运行中的遗传稳定性仍是一个限制问题。PAT已经不是一个新概念了，但其在连续生物工艺中的适应性仍有不少挑战，需要大量的R&D工作。与监管机构及设备供应商的紧密合作可促进技术的开发和使用。

监管：FDA对连续工艺的观点是鼓励性的，从Vertex使用连续工艺生产的Symdeko的获批可证实这一点。FDA强烈推荐生物药生产商在连续工艺开发的所有阶段，与监管机构尽早且更多的讨论、沟通。

连接USP和DSP会改变工厂的设计。通常，多个生物反应器来料会进入单个DSP链，特别是多产品工厂。在此类情况中，连接USP和DSP需要额外的DSP链，一个对应一个生物反应器。连接USP和DSP对于单产品生产链来说最有意义，特别是如果USP使用灌流模式以更长的时间进行操作。

原文：B.Halan, W.Minas, Continuous Bioprocessing: Promises and Challendes. BioProcess International, 2020, 18(3)E1.