脂质体相关药物产品的潜在连续生产方式
本文节选自《Potential of Continuous Manufacturing for Liposomal Drug Products》，内容有删减。由于水平有限，不当之处，还望谅解和指正。详细内容，请参考原文。
简介
在制药行业，连续生产是一种新兴的工艺概念，执行时，原材料连续不断地流入一个工艺，中间体或终产物连续不断地流出。这一概念在许多非制药行业有着悠久的历史，最近也已被用于某些类型的制药工艺，如合成活性药物成分(API)和生产固体口服剂型(片剂等)。实施这一概念的潜在好处包括经济优势(更低的资本支出、更小的设施占地面积、更低的商品总成本[COG])，以及更优化的产品一致性和质量。随着这一概念的成功和被更多地认可，其正在被越来越多地应用到制药生产中更复杂的领域。
近几年，连续生产已经开始进入生物药的生产。生物药生产方案的持续发展，需要考虑连续操作的上游和下游单元操作，如细胞培养、层析、病毒灭活、切向流过滤(TFF)以及整合的连续上游和下游工艺。对于连续灌流细胞培养，生物药生产已经从内置的旋转滤器转向了用于培养基置换的外部截留装置，如交替切向流(ATF)或TFF系统。TFF系统通过切向液流清洗膜表面，以支持连续的过滤，而ATF使用循环的反冲洗。单通过切向流过滤(SPTFF)已被评估用于细胞培养收获液浓缩和蛋白质浓缩，以使该工艺步骤以连续方式进行，而不是传统TFF所需的批量模式。考虑到可以应用于脂质体药物产品制剂的经验教训，这些在连续过滤操作方面的工作尤其值得关注。对于连续生产商业化实现的其它方面，例如过程分析技术(PAT)的需求和一次性使用组件提供的潜在优势，已经在其它文章中进行了探讨。获得的共识是，围绕PAT的关键工艺监测是连续工艺的基本需求，因为它取代了批处理中间体的检测，但更多的细节还留待最终用户解决。一次性使用技术的实施提供了与批量生产工艺相同的、概念上的益处，但随着一次性使用产品所生产的产品量的增加，其效益还会进一步显著提高。对这些方法/方面的评估可得出这样的结论，在生物药中实施连续生产可以提供潜在的、类似于传统制药产品生产方面的优势。
这一结论推动了在产品家族中，连续工艺的应用，包括脂质体药物产品的生产。脂质体产品的生产与连续制药生产有一些共同之处，但也有一些需要进一步探索的独特之处。通常，脂质体产品是原料药的“新”制剂，旨在减轻临床不良副作用和/或提供比系统性给药更有针对性的给药方式。因此，脂质体产品具有一些与固体口服产品相同的方面(包括原料药制造/采购/供应链)，也有一些来自生物药的方面(如混合容器、TFF、过滤等)，此外，还有一些其自身的独特方面。
脂质体药物产品连续生产的定义
连续生产有很多不同的定义方式。一些人认为这个术语应该应用于那些每天24小时、每周7天、每年50周运行的工艺。另有些人则表示，该术语还应包括中间缓冲容器或原料药与药品之间工艺中断的限制。在许多情况下，连续、半连续或其它术语是不相关的。每个工艺和产品都应该单独评估，以确定哪些连续工艺的概念是有益的，哪些不是。转化为连续工艺并不总是可行的，只有在彻底评估后才能实施。
对于脂质体药物产品的生产，一般认为其最终产品是现有API的重新制剂，因此，可用的API可以有很多从成本上考虑更为经济的来源，特别是就相比将药物底物和药物产品生产结合到同一工艺的复杂性而言。这里的重点是介绍脂质体制剂的制备过程，以及如何实现连续生产，并为脂质体药物产品提供效益。
脂质体生产
脂质体最初在20世纪60年代初被发现。从那时起，一些策略已经被证实可用于其生产。但直到最近，脂质体产品在制药中的应用发展仍受限于缺乏可提供足够吞吐量的可靠生产方法，而使商业化规模放大存在不小挑战。一般来说，脂质体合成策略专注于解决和优化囊泡组装中的一个或多个关键驱动力，包括成分溶解性、浓度以及过程热力学参数(即温度、压力等)。生产方法可经多方面的设计，而调节具有不同性质的脂质体，在此操作过程中，可能带来有利于或不利于大规模生产的条件。此外，生产方法的选择往往取决于临床疗效对最终产品的要求，包括脂质体的粒径和粒径分布、脂质组成和药物释放特性，这些共同决定了吸收、分布、代谢和消除(ADME)的药代动力学过程。
最基本和最早的脂质体形成方法以多步合成策略开始，包括在水性介质中进行磷脂薄膜的再水化，这可自发形成具有不同粒径、形状和层数的脂质结构。为了获得均一的产品，需要在成形后，对悬液执行机械粒径操控启动策略。这些方法的结合，虽然有效且已众所周知，但已被证明不便于大规模生产。最近，研究工作开始关注于单步可放大技术的可能性，该技术基于可编程在线工艺策略，以达到控制沉淀及随后的磷脂自组装形成均一结构的过程，这是在规范化制药环境中进行工艺处理的理想方法。
脂质体形成方法
目前，用于脂质体生产的可放大方法的最成功例子采用了乙醇注射(图1A)或错流技术(图1 B)的原理，操作时，通过乙醇和水相的相互扩散方式，溶解的脂质从有机溶剂沉淀至水溶液(抗溶剂)中。在此过程中，脂质局部溶解性的变化最终导致包封了少量水溶液的脂质体的自发形成。根据API的化学性质，它可以被封装在水核中，也可以嵌入在脂质双层中。这种方法形成脂质体的关键参数是有机溶解的脂质与抗溶剂混合/交叉的停留时间和几何结构，而这取决于程序液流条件。脂质体形成后，含有不需要的有机溶剂和未封装API的混合物，可以使用TFF或类似方法，精制到所需的制剂强度和组成。
脂质体药物生产流程图 - 批次模式。A）乙醇/乙醚注射法：脂质/溶剂溶液直接进样至中央罐。B）错流方法：溶剂/抗溶剂在交叉点在线混合。A、B）操作获得的制剂再经多个缓冲液置换洗滤和浓缩步骤精制。
研究提出的几种用于连续脂质体药物产品生产的工艺设计：A）单罐缓冲液置换TFF和单步并行浓缩SPTFF，B）连续多步（多罐）缓冲液置换TFF和单步并行浓缩SPTFF，C）单罐缓冲液置换TFF和多步并行浓缩SPTFF，D）多步缓冲液置换及并行浓缩SPTFF。
所有上述操作生产方法一般都被设计为批处理工艺，但是基于注射和错流方法的脂质体的形成步骤，从其自然机制来看，其是连续的(图1)。只要每种进样液流连续不断，脂质体将不断地形成。值得注意的是，超临界流体和稠密气体方法使用其名字对应的物料作为脂质溶液的溶剂，而注射和错流方法使用有机溶剂。虽然原理类似，但超临界和致密气体进料溶液需要高压，很难适应连续的设计。注射法和错流法在接近环境条件的条件下制剂，是适应连续操作的最实用的方法。(对每种方法的连续生产适用性的评论，参见表1)。随着进样溶液的连续制剂，脂质体的形成步骤可以“无限”进行。通过加入连续的步骤，类似于在生物药工艺中所探索的步骤，可支持将药物产品精制为所需的最终制剂，脂质体药物产品的连续生产是一个可行的概念。
连续脂质体生产的挑战
虽然脂质体药物产品生产的核心步骤(脂质体形成)有利于连续生产，但在制剂精制、结构材料和无菌保障等方面有着特殊的细微差别需要解决，以适应规范化的制药环境。
制剂精制
脂质体形成的下游单元操作用于将药物产品精制到所需的规格。通常，会使用诸如TFF这样的单元操作，去除不需要的元素，如未包封的API或有机溶剂，并将药物浓缩到最终所需的强度。在这种情况下，回流液含有药物产品，而滤液为废弃液。这与生物药生产中的下游单元操作没有什么不同。在脂质体药物生产中，用于缓冲液置换和浓缩的TFF需要适当平衡，以支持连续操作。该操作的批次模式设计需要一个新的TFF步骤，即将含有脂质体的回流液返回到中央容器，滤液/废液以新鲜缓冲液进样(恒量洗滤)组成，促进缓冲液置换。一旦缓冲液置换完成，通过停止添加缓冲液，将产物浓缩到所需的强度(图1)。连续设计可实现连续的缓冲液置换，同时并行进行浓缩步骤。这样的设置在生物药领域并不陌生，但需要考虑脂质体的特性，并对操作进行实验测试。根据进料的组成和所需的最终制剂规格，这可以通过各种设置来优化。使用单步并行浓缩SPTFF的单容器缓冲置换TFF系统可作为连续设计的基本情况。如果稳态洗滤或单通过浓缩不能达到所需的缓冲置换速率或单步浓缩，则可以添加更多的步骤。
对于脂质体制剂，SPTFF的应用从很多方面来看，还是未知的，但已有数据显示，SPTFF可用于细胞培养收获的浓缩或蛋白质浓缩。虽然不能假设脂质体的行为与细胞或蛋白质相同，但与细胞悬浮液和蛋白质溶液相似的是，脂质体制剂在浓缩过程中粘度会呈指数增长。由于最终的浓度规格通常只有一个较窄的公差，此类操作需要高水平的控制和准确性。这就对连续生产提出规范化要求，过程分析技术(PAT)。
在脂质体制剂的生产过程中，活性成分的捕获效率有允许的、且可预期的变化。在批次工艺中，这可以通过在浓缩步骤之前、对活性成分浓度的离线过程中检测进行补偿。虽然流速、质量和密度等基本检测提供了一定程度的控制，且在连续操作中很容易实现，但实时浓度检测(如在线HPLC)将提供更高水平的保证。虽然目前已有商品化的在线HPLC方法，但其仍需要继续发展，以克服检测要求中的挑战，如其需裂解脂质体来确定浓度，这使其成为一种破坏性的检测方法。反馈延迟问题可以使用其它过程控制方法来克服，Rapid HPLC，其可将离线测试时间从60分钟减少到4分钟。其它在线检测，如颗粒粒径，也可能适用，因为可以将其与浓度数据关联。
结构材料
生物药连续生产的优势可通过整合一次性使用系统和部件实现。这消除了对昂贵设备的需要，简化了清洗、消毒/灭菌，并可为多产品操作提供更多的灵活性。然而，对于脂质体的生产，一次性使用产品存在几方面的挑战。由于脂质体的生产需要使用有机溶剂，使用一次性使用部件，如管路和料液袋，可能会带来有关溶出/析出的问题。此外，如果一次性部件使用伽马辐照进行预灭菌，可能会产生可与药物产品结合的自由基。最终，这会导致脂质体组分的降解和/或需要对终产物中之前未检测到的杂质进行表征。一次性使用部件的另一个挑战是其保持无菌屏障的能力。
无菌性保障
在绝大多数情况下，脂质体的商业化规模生产，需要无菌工艺。这是由于脂质体的粒径大小通常接近或大于0.2μm(无法进行最终除菌过滤)，且脂质体在过热、腐蚀性化学试剂或辐射(即高压蒸汽、汽化过氧化氢（VHP）、电子束以及伽马辐照)条件下不稳定。使用无菌工艺时，需要在工艺外围建立和维持无菌屏障。与可重复使用系统(如不锈钢)相比，关于一次性使用部件，如料液袋和管路部件，的一个顾虑是泄漏风险。此外，软管在泵送系统中的长时间使用也可能出现剥落和断裂。
除了通过设计一个耐用的整体边界来建立无菌保障外，必须通过模拟和验证，来证明保持无菌工艺的能力。假设该工艺使用预灭菌部件和/或在线蒸汽(SIP)设备，所有进料溶液(含有API的水性溶液、含有脂质的有机溶液或缓冲液)必须经过孔径小于或等于0.2μm的除菌过滤器，才能进入系统。除菌过滤步骤的能力(过滤器去除给定浓度的微生物的能力)和持续时间(微生物通过可损坏过滤器之前的使用时间)进行验证。对于连续设计，持续时间是最令人关注的，一般的经验法则是除菌过滤器的使用需低于4小时。要克服这个问题，要么使用有较高冗余的过滤设计，要么是平行过滤通路的依次使用。依次使用平行通路是一种更可行的解决方案，因为多个冗余通路会导致显著的压降问题。(注:大多数监管机构要求将包含两个过滤器的冗余过滤作为标准做法)。
无菌工艺验证或培养基模拟的要求进一步建立在无菌保障措施的基础之上，如预灭菌部件、SIP和除菌过滤验证。无菌工艺验证包括处理生长培养基，代替进样溶液和产品，以进一步建立保持无菌工艺的能力。这些模拟应该覆盖连续操作的预期持续时间，其可能导致对连续生产定义的修正。最后，从操作的角度看，模拟一个持续多月的工艺是不实际的。模拟与生产相左，无菌屏障的风险随着工艺的持续时间直接增加。在确定连续设计的持续时间时，应该考虑生长培养基模拟失败的风险。而FDA的指导意见认为，与生产的产品产量相比，连续操作更为有利的一点是，启动和停止的操作次数降低了，而大多数导致失败的故障往往发生在这两个阶段。最后，每个工艺都应该确定一个风险/收益的拐点。
另一个要考虑的问题是原液和/或灌装的最产品的无菌取样计划。目前还没有微生物学方面的PAT，因此通过上述设计和验证，加上统计上合理的取样计划，以保证无菌性。对于批次工艺，在进行灌装之前，要抽取单个原液样品，以确保无菌性。如果将连续灌装整合到该工艺中，则原液需连续流向灌装操作单元，妨碍了代表性原液样品的抽取。这可以通过在灌装操作过程中，另取样品来补偿，以代表实时的原液和灌装单元。目前，无菌保证的要求和微生物学PAT的缺乏阻碍了实时放行措施的实施，因为在没有获得所有原液和所有终产品样品通过微生物学检测的结果之前，单个单元就不能放行。这是另一个需要考虑的风险/收益评估因素。
收益评估
基于上述脂质体制剂生产中可行的连续操作的假设，可以进行一个基本的案例研究。对于案例研究的目的，是比较下列选项：1)使用支持批次工艺的步骤，通过1h的脂质体形成步骤，生产灌装2,500剂的批次工艺设计；2)使用并行连续单元操作，实现24小时脂质体形成步骤的连续工艺设计。批次工艺基于用于早期临床生产的实际例子(即25L原液，10mL灌装)。假设，批次和连续设计使用相似规模的设备以及相似的处理速率(即1,250剂/h的灌装速率)，单元操作和工艺时间概述参见图3。
批次工艺在20h的总工艺时间内，能够生产灌装2,500剂，包括准备 (组装、CIP/SIP等)，或125剂/h，使用24h脂质体形成的连续工艺可在57h的总工艺时间内，生产灌装 60, 000剂或1,053剂/h，这意味着，在相同的成本(按每小时单位计算)下，产量增加8.4倍；在相同的工艺准备成本和一次性使用部件成本(除菌过滤器、TFF组件)下，产量增加24倍。此外，随着灌装速度的提高，可进一步提高产量，并节省成本。
另一种比较这两种工艺的方法是其实现给定生产预测的能力。对于1x10^6剂/年的预测，连续设计只需要57小时的工艺流程每月运行不超过1.5次。而在批次设计中，20小时的工艺每天要运行不止一次，即需要多条生产线、以更高的速度运行，才能实现预测。
通过将早期临床规模生产线转换为连续操作，不仅节省了成本，获得了更高的吞吐量，而且减轻了工艺规模放大的需要，从而消除了支持工艺开发工作和大规模高成本设备采购的需要。
总结
连续生产是一个对许多行业都有明显好处的概念。生物药领域率先将这一概念应用到了制药行业，但现在它的应用可以进一步扩展到药用脂质体药物产品。如果在设计过程中，考虑了相关的单元操作、结构材料和无菌保证，脂质体药物产品可从连续生产收获经济和质量效益。
原文：R.D.Worsham, V.Thomas, S.S.Farid, Potential of Continuous Manufacturing for Liposomal Drug Products. Biotechnology Journal, 2019, 14, 1700740.