工艺层析的最新技术创新

本文节选自“Technology Innovations Improve Process Chromatography Performance”，更多详细内容，请参考原文。

为生物药生产选择合适的分离技术是在下游生物工艺中最大限度提高生产力的关键任务。生物制药厂商在为他们的产品选择最佳的层析技术时考虑几个关键因素包括生物药的稳定性、所用缓冲液的相容性、以及规模放大的容易程度。最近工艺层析的发展解决下游分离和纯化的部分挑战，优化了生物工艺。

当前的挑战

生物制药行业在层析工艺方面仍然面临技术方面的挑战，特别是在规模放大的过程中。虽然行业在上游生物工艺方面做了很多重要的工作，通过一次性技术的使用、更好的原材料表征、以及更精确控制的生物反应器的使用，消除了大部分瓶颈，但下游工艺的发展并没有跟上步伐，Avantor的研发副总裁Nandu Deorkar说。

“在下游工艺中，生物制药厂商的最终目标是提高回收率，降低每克蛋白质的生产成本。目前，生产一种新型生物药的成本中，仍有超过60%的成本与下游工艺有关，比如资源、材料和设备，收获材料需要经过多单元的下游纯化操作，这会增加大约30%的工作。下游收率的一点点提高都将有助于提高目标生物药产品的最终工艺收率。”

Deorkar还指出，Protein A填料的供应链缺乏多样性（该填料用于单克隆抗体(mAb)生产下游层析的第一步）。他说：“从我们目前需要使用有限的动态结合载量来处理高滴度的细胞培养收获液的现状，就可以看到这一短板。”

Sartorius层析部门经理Hemanth Kaligotla说，层析柱装填性能的可再现性可促进技术在生产中的实施，其是确保一致的规模放大的关键。“对于基于膜的层析产品，不同规模设备的可用性以及不同尺寸设备的性能都需要一致。设备内的液流分布仍然很关键，”Kaligotla强调。

Cytiva的研究人员Ian Scanlon和研究工程师Zachary Sexton表示，缓慢的处理时间是另一个大问题，尤其是现在生物制药行业正在寻求缩短供应链，并“在床边”生产药品。减少清洗和清洗验证的成本也是许多大公司和合同制造组织(CMO)/合同开发和制造组织(CDMO)所讨论的挑战。“即使有了些缓解策略，这两个步骤通常还是会导致大量的“无产出”时间。一次性使用解决方案可以通过简单的即插即用形式消除大量的停机时间，”Scanlon说。

“生物制药行业的两个目标是可放大性和灵活性，”MilliporeSigma生物工艺研发负责人David Beattie指出，“从第一个临床批次到全规模生产，下游设施应提供可靠的产品质量。对填料、缓冲液和设备等材料的依赖性是非常重要的，这些材料都是为生产目的而设计的，并在数量上可满足需求。”

“另一个目标，灵活性，对于新型疗法尤为重要。双特异性抗体、抗体-药物偶联物、工程糖苷异构体、融合蛋白 - 所有这些分子都需要使用具有可预测行为的填料的模板方法进行纯化，”Beattie继续说道。

过去的挑战

幸运的是，下游工艺层析以往的挑战已经通过创新技术、设备或方法而被克服了。Kaligotla说，层析法几十年来一直是生物制品纯化的主要工具，它不断地推动着生产力的优化和商品成本的降低。

“我们看到混合模式填料使用的增加，因为它们为极具挑战性的分子提供了更高的选择性，同时使开发一个稳健的工艺所需的进样液流操作最小化。特定的亲和填料也正在开发当中，以实现有效且直接的单步捕获步骤，而获得高纯度。我们可以在新的生物靶标(例如腺相关病毒[AAV])中看到这一趋势，目前还没有建立平台化的工艺。对流膜层析和整体柱通过扩散性基质解决了之前纯化大分子的挑战，如病毒(> 100nm)、质粒、甚至大型蛋白复合物，”Kaligotla说。

Kaligotla补充道，工艺简化已经成为了一个尤为突出的解决方案，其通过优化工艺，消除无附加值的步骤以及单元操作之间的断联。工艺强化是另一种可行的办法，通过这种办法，可以减少设备的占地，使生产更加灵活。我们还看到了在实时产品质量监测领域的大量工作，包括实时/自动化事件控制，以实现实时放行和连续工艺，”Kaligotla说。

与此同时，进行筛选实验所需要的大量工作构成了另一个重大挑战。Kaligotla说，客户可以从与特定供应商的合作中获益，后者提供高通量筛选工具，包括预装填的层析柱、高通量筛选系统以及使用稳健实验设计（DoE）软件工具设计的良好研究平台。

Sexton指出，配基开发有助于增强开发过程的稳健性。Sexton说:“与底物有较高亲和力的配基或者更能抵抗苛刻清洗程序的配基会更受青睐，因为这样可以节省客户的金钱和时间。”硬件创新，如模拟移动床(SMB)，周期性逆流(PCC)，或其它系统，允许用户更有效地使用新兴的填料，他补充道。

Sexton说:“我们也看到，由于监管限制，在确保客户安全方面施加了限制，比如针对GMP(良好生产规范)环境的毒理学和清洗验证，现成的技术变得更有吸引力。”

允许以高线性流速实现无缝规模放大的压力稳定性层析填料的开发，是另一项创新，可帮助行业解决过去的层析挑战，Beattie说，解决更高灵活性需求的另一项创新是基于一次性使用膜的层析技术的采用。“传统上，由于吞吐量的限制，基于填料的层析柱往往过大，且不适合灵活生产。这些因素对生物疗法生产的纯化方案的设计提出了挑战。

膜吸附可增强工艺灵活性和稳健性，并降低了成本和风险。好处包括更快的处理速度，这可以提高生产率；无需装柱，省时省力；无需批次之间的清洗操作，允许快速切换；消除批次间交叉污染的风险；并且仅需更小的设施占地，Beattie举例说。

Deorkar补充说，在下游工艺中寻找规模的效率和经济性，涉及到更复杂的分析和优化。在调查了当前纯化步骤和技术的各个方面后，可以达到优化的目的。这些优化包括扩大混合模式和多模式层析填料的使用范围，特别是使用具有旨在提高选择性的配基的填料时，可帮助工艺更有效地靶向分子；探索使层析缓冲液更有效的方法，可以使用新型添加剂和一次性使用的预包装缓冲材料，以简化缓冲液置换步骤；以及更广泛地使用数据分析工具。Deorkar说，数据可以帮助质量和工艺优化工程师更深入地了解下游工艺步骤中复杂的材料相互作用，特别是与原材料特性有关的工艺。他补充说，原材料的变化可能会带来严重的问题，影响下游的效率，并可能导致长时间的调查，且潜在地延误向为患者提供所需的药物。因此，材料的高度表征是半导体制造业采用的一种最佳实践，可以为生物制药厂商提供对集成供应链中材料差异性的进一步了解。

Deorkar继续说道:“Protein A的新选择，例如Avantor开发的新型重组Protein A填料，[可以]解决供应受限的挑战。这种新填料建立在一种专利配基上。此外，目前的Protein A产品配方需要易燃化学品的储存和运输，这需要特定的安全预防措施，并导致额外的运输和操作成本。Avantor通过将其新填料以一种不易燃的储存缓冲包装，解决了这个问题，其没有与易燃物相关的限制或在存储和运输中需要特殊的操作，”Deorkar解释说。

连续层析

随着连续生物工艺得到越来越多的关注，有必要评估目前的工艺层析技术是否对实施连续工艺造成任何限制或风险。根据Scanlon的说法，无论是在技术/实施方面还是在管理方面，向连续生物工艺的发展都存在一定的风险。其中经常讨论的问题是如何定义批次的开始和结束，以及如何在发生不可避免的错误时，将污染的影响最小化。

“批次工艺相对容易，因为它有明确的控制。当所有的东西混合在一起，并且如果您的监测是在线的，您很快就会意识到问题的发生，区分哪些是受影响的，哪些是不受影响的至关重要。你需要二级指标，指示您哪些正在往超出规格范围的方向发展，这样，您就能在连续分离工艺变得不佳之前就意识到，避免昂贵物料的损失以及为解决问题而必需进行的长时间的调查,”Scanlon说。

“我们已经看到了吸附方式特性的巨大改进，无论是填料还是膜。这些更大的孔隙结构可在更长的使用寿命内获得更好的压力特性。灌流滴度还将随时间增加，就像以前的批次工艺一样。这将产生对下游工艺进行进一步优化的需求，目前正在开发中，”Scanlon补充道。

连续工艺也使事情变得更加复杂，从流路的复杂性到连接和以及为了保持同步而进行的编程，Scanlon继续说道。更复杂的是，CMO/CDMO使用的设备来自不同的供应商。Scanlon认为:“如果设备设计不具备这种互操作性，那么在连续工艺中获得互操作性将是一个挑战，而且可能需要某种中间性的衔接硬件，而这些硬件可能需要定制。”

Beattie说:“行业正朝着强化、互联和连续的生物工艺方向发展，我们预计，进入临床生产的新分子中，至少约有30%将基于上游或下游操作的强化工艺。”

Beattie指出，连续mAb精制层析的瓶颈之一是阳离子交换步骤，传统上其以结合和洗脱的方式进行，以清除产品相关的聚合物。“结合和洗脱层析可以使用多柱系统进行连续操作，缓冲液消耗相对较高，产物洗脱经常发生在高盐条件下进行，这就需要稀释或缓冲液交换，以保持与下游单元操作的兼容性。一种更有效的纯化策略是在产物流穿模式下操作阳离子交换步骤，而不是结合和洗脱模式，”贝蒂解释说。“从连续工艺的角度来看，流穿模式的阳离子交换步骤更容易与其它产物流穿纯化步骤整合，如阴离子交换精制或除病毒过滤，而不需要调整电导率或进行稀释。”

虽然一些生物工艺是在半连续的基础上运行的，但完全连续层析仍存在一定的限制，如不同的层析单元和过滤单元操作的连接，Deorkar说，以及多个层析步骤可能使用不同类型的缓冲系统。

“作为这些工艺流的一部分，缓冲液置换是必需的，而且通常很难连接。如果是火车，非常容易通过桥接从一节车厢跳到另一节车厢。但是如果没有这个连接器，火车将会分离并丢失一部分货物。所以，需要的是一个无缝连接器，使层析和缓冲置换步骤能够协同工作。一旦完成了这一任务，就需要确保各种缓冲液的供应。这可以通过使用水化浓缩缓冲液或预称量固体颗粒的直接配送来实现，以提高缓冲液制备操作的灵活性和效率，”Deorkar解释说。

Kaligotla支持这样一种概念，即在保持稳健的过程控制和风险最小化的同时，将多个单元操作整合在一起，这是连续生物工艺的基本关注点。“目前的工艺技术，如用于[层析]系统的功能性封闭的一次性使用集成管路、预装层析柱以及稳健的传感器部件，可使在生物负荷降解环境下的长期工艺处理成为可能。”这些技术正在慢慢成熟，而且人们还在不断努力，以开发更先进的实时在线分析技术，以优化连续工艺，”Kaligotla说。

Kaligotla指出，与这些日渐成熟的技术相关的风险包括耗材的高成本、长期使用过程中流路的完整性、有限的溶出/析出数据以及对生物负荷的担忧。

最近开发的技术的应用，如单次通过超滤/洗滤，以及Protein A后的连续病毒灭活步骤，使这些步骤能够在真正连续的模式下运行，”Kaligotla说。

下游响应上游规模放大

当行业看到由于一次性使用生物反应器尺寸的增加以及细胞培养条件的优化而使上游工艺的滴度显著增加时，下游对上游规模扩大的反应是什么?贝蒂认为，下游工艺的响应将在不同工厂中以不同的方式实现。

在多产品工厂中，更高滴度的上游工艺可以减少生产目标产品量所需的批次数量。这为增加每个工厂的分子数量提供了机会，Beattie观察到。“如果没有高产量、快速转换和低交叉污染风险的一次性使用纯化解决方案，这一目标是无法实现的，”Beattie说。

Beattie继续说：“另一种策略是增加现有工厂单个产品的总产出。在下游，这不仅会导致层析柱尺寸的增加，还会导致缓冲液体积的相应增加，这可以通过使用缓冲浓缩液来克服。”

Deorkar补充道，增加下游设备的规模也是为了应对上游产量的增加。此外，如果单元操作允许更快的流速，多循环也是可能的。“这就像单个单元操作中的连续工艺。在这种情况下，压力是放在了缓冲液供应链，因此有必要确保缓冲液准备工作是有效的且可放大的，”Deorkar说。

然而，增加下游设备的规模也意味着成本的增加，Sexton说。不过，他指出，行业将进行创新，创造性地解决这个问题。“其中包括扩大下游领域的规模。它可能包括一个更小的占地，以确保现有设备尽可能高效地运行。简单的解决方案是让所有东西都变得更大，但更好、更有效的解决方案是让当前的工艺更高效，”Sexton说。

Sexton补充说:“还有一种观点认为，随着行业趋向于高效、个性化的药品，并缩小供应链缺口，这种模式将更多地转向在各个地区进行物料的小批次生产。”

Kaligotla补充道，上游工艺中更高的滴度会影响下游操作循环的次数和整个工艺的时间。更高的滴度也进一步给工艺调度带来挑战；上游产量越高，瓶颈就越会从上游转移到下游。“滴度越高，杂质水平就会相应增加，下游对深层过滤的需求就会增加。解决这种产量提高的一个实际方法是利用多柱方法。由于功能性封闭的一次性使用集成管路的成功商品化，这种方法最近获得了较多的关注。这种集成管路包括了稳健的传感器部件，能够在临床或商业生产阶段、生物负荷更低的环境中进行长期操作。Kaligotla还说，节约的物料成本和提高的生产力效益使这种单元操作更具吸引力。

原文：F. Mirasol, “Technology Innovations Improve Process Chromatography Performance,” BioPharm International 33 (9) 2020.