工艺开发中，产物滴度和CQA的在线/近线检测、分析和控制

本文节选自BMS（百事美施贵宝）研究人员发表于2020年8月的《Biotechnology & Bioengineering》的文章“Online/At-line Measurement, Analysis and Control of Product Titer & Critical Product Quality Attributes(CQAs) During Process Development”。详细内容，请参考原文

过程分析技术(PAT)被美国食品和药物管理局(FDA)定义为通过及时的测量来设计、分析和控制生产以确保最终产品质量的系统。根据质量源于设计(QbD)原则，实时或接近实时的数据监控对于及时控制关键质量属性(CQA)至关重要，目的是使工艺保持处于控制状态。为了促进下一代连续生物工艺，部署PAT工具进行实时监控是实现工艺理解和控制的一部分。CQA的实时监控和控制是将工艺保持在设计范围内并与QbD的指导原则保持一致的关键。本文主要介绍上游滴度和下游产品质量的在线（on-line）/近线（at-line）监测以及及时工艺控制。UPLC系统结合过程样品管理器(UPLC-PSM)可以用于生物反应器和下游单元操作的直接滴度和CQA检测。研究人员建立了用于补料分批和基于交替切向流(ATF)的灌流生物反应器的在线滴度检测方法，以及针对实时峰收集的下游操作产品质量评估。这种集成的完全自动化在线数据监控及反馈控制系统设计旨在达到理想的产品质量。

简介

在过去的十年里，生物制药行业已经接受了从关注产量提升到关注产品质量优化的模式转变，目的在于增强蛋白质疗法的效率、效价和安全性。过程分析技术(PAT)支持的工具可实现实时监控，这对于提高工艺和产品理解、以保持获得一致的产品质量至关重要。质量源于设计(QbD)的重点是设计和开发良好的工艺，以始终如一地获得具有预定义质量属性的产品。单克隆抗体(mAb)的细胞培养补料分批工艺可获得高达5 g/L的浓度。优化关键质量属性(CQA)现在是目前实现最高产品质量的首要关注点。除了采用QbD框架和PAT工具外，新的重点是基于科学和风险的方法，包括使用连续生物工艺，以达到预期的产品质量。

生物制药公司正在从“质量源于检测”的理念向“质量源于设计”的模式过渡，其正在建立多变量分析工具，以提高对产品和工艺的理解，从而遵从FDA的PAT指南。主成分分析和偏最小二乘回归方法被用于建立可预测的产品质量属性。根据FDA的指南，PAT工具可用于及时测量并控制工艺，以确保获得所需的终产品质量。QbD的指导原则旨在减少工艺变异性，增强工艺/产品理解，以符合FDA将产品质量构建到工艺中的理念。

使用统计设计的实验进行实时工艺控制需要多变量分析工具，以分析来自多维数据库的数据。要使用多变量分析开发预测模型，必须建立工艺与产品之间的相互关系。利用PAT工具生成的实时数据对于建立基于DOE的过程控制设计空间至关重要。目前使用的批次工艺成本高、效率低、缺乏生产灵活性。利用PAT工具，从批次转变为连续生物工艺，可以增强源于QbD理念的工艺和产品理解，并为高经济效益的生产开辟了一条新途径。

正如FDA所强调的那样，未来25年，生物药生产将朝着更简洁、更灵活、更高效的连续生产方向转变。FDA鼓励基于风险的方法，支持针对药物开发和生产的QbD原则，但同时也指出增加检测并不总是会提高产品质量。生物制药行业的当前目标是实现更高的工艺效率，同时降低成本，且不影响产品质量。整合式连续生产(ICM)有望提高生产率，获得一致的产品质量，降低设备尺寸，简化工艺流程，并减少工艺循环时间和总成本。

连续生物工艺通过利用可控且灵活的单元操作，实现高质量产品的高效生产。包括FDA、EMA和ICH在内的监管机构已经开始推动持续生物工艺，以提高产品质量。连续生产预计将使每座工厂的资本支出减少100 – 1,000万美元，资本成本和运营成本分别减少40-50%和20-30%。自2004年以来，监管当局已要求新审批的工艺使用QbD和PAT。由于缺乏支持QbD驱动的连续生物工艺的分析方法，FDA鼓励制药公司开发PAT工具以配合QbD。为了开发高质量的药物，使用QbD和最先进的技术，如PAT，是至关重要的。Bayer公司认为，当前在生产过程的末端检测产品质量的模式不符合现代化的过程控制策略。随着统计建模的发展，PAT和DOE概念的整合是不可避免的。

在本文中，我们将介绍几个我们开发的PAT工具研究案例，以支持生物制药工艺发展以及中试规模的连续生物工艺。所提供的数据代表了我们不断努力建立新兴PAT工具的工作，以弥补在强化工艺/产品理解以及实时过程控制方面的一些现有差距。正如Kornecki和Strube所指出的，在生物工艺过程中，实现工艺稳健性以及获得工艺理解的需求越来越大。而监管部门致力于整合PAT工具，以通过提高工艺理解和控制，来提高产品质量的工作进一步证实了这一点。我们进行这项工作的灵感来自于我们的使命，即克服在执行连续生物工艺过程中遇到的挑战。Vargas等人指出，连续生物工艺发展过程中的挫折可能是由于PAT工具的开发缺乏相应地进展，而PAT工具对于良好控制且稳健的生物工艺至关重要。为了开发在生物工艺过程中检测、分析并控制产品质量的在线工具，我们使用FISP®探针和AKTA™以及用于自动提取样品的定制T-接头，对上游生物反应器的过程样品管理(PSM)模块进行了改造。有了这种全自动的配置，滴度和产品质量分析，如天然和变性体积排阻层析(SEC和dSEC)，可以在预先设定的时间内进行。

详细的实验操作和结果，请参考原文。

讨论 

在本研究中，我们对UPLC结合PSM自动采样器的方式进行了概念验证，以便于上游滴度和下游产物质量的在线监测和控制。从生物反应器和AKTA™过程分析仪中自动取样不仅可以增强对工艺和产品的理解，而且还提供了控制工艺、以达到QbD指南中说明的预定义产品质量的机会。促进QbD和PAT在连续生物工艺的在线监测和控制中实施，对于提高工艺的稳定性以及产品质量都至关重要。UPLC-PSM模块与单元操作(如生物反应器和AKTA™)相耦合，以进行自动采样和分析，已被归类为在线分析模式，尽管与生物传感器和光谱分析仪等在线分析技术相比，其测量存在较小的延迟。

生物反应器/ AKTA™与UPLC进样器之间的经过时间为1-2 min，显著低于样品滴度或产品质量变化所需的时间，从而满足了在线测量的定义。Whitford和Julien进一步支持了这一观点，他们认为使用附加的HPLC/UPLC进行的分析可被认为是“在线分析”。各种文献中其它例子,也支持这一策略的在线分类。虽然自动HPLC/UPLC数据已被接受为在线数据，但它的实时或近实时分类仍有争议，因为这两个术语在不同文献中经常互换使用。为了区分在线数据（on-line）和入线（in-line）数据，并与Whitford和Julien提供的分类保持一致，我们采取了保守的方法，将我们的在线UPLC数据称为近实时数据。鉴于PSM自动采样器估计的1-2 min的采样延迟时间和≤5 min等待UPLC分析，进一步说明了这一点。

图2. mAb-1离线滴度数据与在线和近线UPLC-PSM数据比较。第14天值为离线：2.3g/L；在线：2.2g/L；近线：2.3g/L.

图3. Tukey's HSD检测显示，在线、近线和离线滴度结果具有统计可比性。

图2展示了不同分析模式(在线online、近线atline和离线offline)下补料分批生物反应器滴度结果的可比性。三种分析模式之间的表观差异在使用Protein A方法进行滴度测定的变异性范围内。Protein A滴度分析固有的变异性是整个行业面临的挑战。据Satzer和Jungbauer的研究，Protein A滴度分析的相对标准偏差(RSD)定量检测下限（LOQ）的20%，整个浓度范围为15%。鉴于Protein A滴度测定法检测内变异性的特点，三种分析模式之间观察到的测定间变异性在该方法的固有变异性范围之内。使用Tukey's  HSD(图3)检验进行的统计分析加强了这一推论。我们也拟合了一个时间和采样模式的立方模型，并得出了同样的结论。将时间考虑在内，以时间和采样模式为主要影响，运行线性模型，三种模式之间没有显著差异。

ATF生物反应器在线和近线mAb-2滴度数据的比较

与上面讨论的批次生物反应器的数据相比，使用在线（online）和近线（atline）分析模式生成的小规模灌流生物反应器样品的数据相对更具可比性(参见图4)。更高的可比性归因于在更高的mAb浓度条件下，滴度检测方法更高的精确性，而前者来源于交替式切向流（ATF）灌流生物反应器的“天然特性”。相比批次处理，ATF灌流工艺的目标是使滴度增加数倍，这得益于培养基的循环避免了营养物的剥夺，同时连续去除副产品，从而达到了高细胞密度。表2(见原文)所示为大规模细胞培养收获上清(HCCF)的滴度结果，与在QC中进行的离线（offline）检测结果非常一致。使用近线（at-line）模式的原因是与QC检测相匹配，在此测试中，样品在滴度检测之前要进行絮凝和过滤。在连续细胞去除以及使用层析过滤以去除絮凝的细胞后，使用选择近线分析模式进行分析。这种分析模式是有益的，因为它可以由生产车间的员工进行，且不需要先前的层析背景。

生物治疗药物容易发生聚集、降解和其它翻译后修饰。产物相关的异构体，如HMW和LMW，是风险因子，被认为是CQA。蛋白质治疗药物倾向于形成HMW聚体，并可诱导不良免疫反应。已有文献证明，治疗性蛋白的不良免疫反应影响药物的安全性和有效性，表现为药效降低、输液反应、细胞因子释放综合征、过敏反应，甚至死亡。HMW聚体会引发免疫反应，影响mAb的安全性和有效性，而LMW片段会对药物的免疫原性和药代动力学产生负面影响。因此，在工艺开发过程中对HMW和LMW等CQA进行监测和控制至关重要。

图5. 使用UPLC-PSM在线模式检测的mAb-6 CEX峰馏分的粒径异构体趋势（天然SEC）

图6. 使用在线 vs. 离线天然SEC检测的mAb-6CEX峰馏分的%单体、%HMW和%LMW的比较

如图5所示，使用5-min SEC分析对IEX纯化馏分进行在线（on-line）粒径异构体分析，可以提供各个馏分的粒径异构体信息，并便于及时做出峰汇合决策。图6显示了mAb-6不同馏分离线和在线SEC %单体、%HMW和%LMW的比较图。后洗脱馏分的%HMW略有下降，而单体和%LMW则相应增加。这一趋势可能是单体和LMW非共价交联形成的可逆的HMW的解离所致。样品被提交到检测实验室进行离线分析，可逆的HMW可能在存储期间解离成单体和LMW成分。在新一代单个单元设备中进行的IEX馏分的峰值纯度趋势分析显示了该方法在不同平台上的通用性。图8（见原文）所示的在线dSEC趋势显示了在线获取纯化馏分中共价聚合体分布的能力。在线dSEC检测可以更好地评估LMW物质，因为在变性条件下，被裁剪的物质与完整分子的非共价交联被破坏了。

总结来说，我们对结合PSM的UPLC的实施进行了概念验证，以用于上游滴度检测和下游产品质量评估。在这种完全整合的架构中，通过4-20mA和mV转换器或监视控制和数据采集(SCADA)软件，将来自Empower的UPLC信号发送到Delta-V或其它类似的分布式控制系统(DCS)。整合系统控制UPLC和工艺设备，以促进反馈控制，从而确保所需的产品质量。通过在线测量提高了对产品和工艺的理解，及时地进行控制过程是可以实现的，这与QbD的理念相一致，即使用科学的方法将所需的质量构建到产品中。

平台的优点

与传统的离线检测相比，在线数据生成具有多种优势，包括速度、方便、样品完整性，最重要的是，提供了建立一个具有反馈控制的全自动化平台的机会。加强对工艺和产品的理解，能够及时控制工艺参数，以保持理想的产品质量。该整合平台能够自动进行UPLC分析，并将分析仪器的结果传输到DCS或SCADA软件中，从而实现UPLC分析的全自动化，符合QbD支持的连续生物工艺的要求。

原文：L.Chemmalil, T.Prabhakar, J. Kuang, et al., Online/At-line Measurement,Analysis and Control of Product Titer & Critical Product Quality Attributes(CQAs) During Process Development. Biotechnology & Bioengineering, 2020, https://doi.org/10.1002/bit.27531.