建立悬浮细胞培养，优化溶瘤性腺病毒生产
本文节选自来自《Establishing Suspension Cell Cultures for Improved Manufacturing of Oncolytic Adenovirus》，详细内容，请参考原文。
摘要：最近的临床试验证实了溶瘤腺病毒作为肿瘤免疫治疗的潜力。溶瘤腺病毒成功过渡到临床应用需要高效且与GMP兼容的生产和纯化生物工艺。悬浮培养是最好的病毒生产方式，因其可以降低生产成本，提高产品质量和一致性。本文介绍了驯化A549细胞系适应以血清减少的培养基进行悬浮培养的工作，并在搅拌罐生物反应器中通过溶瘤腺病毒的生产进行了验证。在生产过程中，细胞密度可达到3×10^6cells/mL。收获时，可获得1.4×10^10ip（感染颗粒）/mL和6.9±1.1×10^10 VG（病毒基因组）/mL，对应病毒基因组:感染性颗粒比为5.2(±1.9):1，确认病毒质量。总的来说，A549细胞的悬浮特性支持一种易于规模放大、时间更短且更经济的工艺，可提高利用溶瘤病毒治疗癌症的成功性。
简介：溶瘤病毒是一种极具吸引力的新兴肿瘤治疗方式，因为它们被设计成优先感染癌细胞并在其中复制。这种作用机制可促进细胞裂解，导致免疫系统刺激。自90年代中期以来，有关这些病毒的临床试验就有报道。事实上，2015年美国食品和药物管理局(FDA)批准了第一种溶瘤病毒产品，用于治疗晚期黑色素瘤。腺病毒在对抗传染病方面也显示出了巨大的潜力。因此，已对不同的细胞系进行了评估，现在可用于腺病毒的生产，而人胚胎肾293(HEK293)细胞系是最广泛使用的细胞系。但是，HEK293细胞与工程溶瘤腺病毒有广泛的序列同源性，这会引起严重的安全问题。重组的可复制腺病毒(RCA)群体的出现是由于同源重组事件的发生。因此，这形成了以一种不受控制的方式复制E1缺失的载体。为了避免/防止腺病毒生成过程中RCA的发生，人们致力于通过消除E1缺失病毒中的病毒序列与细胞系中出现的病毒序列的重叠来产生替代性细胞系。随后，人类胚胎视网膜细胞系(PER.C6)被培育出来，并获得了良好的生产滴度，并进一步被合格用于符合良好生产规范（GMP）的生产。这种细胞系的一个主要缺点是，由于严格的许可成本，科学界无法获得使用。其它细胞系也被用于产生溶瘤性腺病毒，如HeLa和A549。因此，缺乏E1基因的A549细胞系被优先用于大多数溶瘤病毒的扩增和生产。
以病毒为基础的治疗方法的生产需要每剂药物中含有大量的病毒。这些工艺的规模放大是具有不小的挑战性，特别是对于依赖贴壁细胞的静态系统，其可放大性有限，只能通过增加培养单元的数量(规模扩展)以及使用缺乏可控培养条件(如pH、DO)的方式来缓解。在搅拌罐(ST)生物反应器中进行悬浮培养时，细胞密度更高，劳动强度更低，占地更小，且便于规模放大。此外，这些培养通常无血清或血清浓度极低，这在生物安全性和临床转化方面也具有优势。动物源性成分的缺失有助于增加批次间的一致性，并消除工艺中的外源性病原体，加快监管部门的审批。此外，监管机构对溶瘤腺病毒产品放行的要求通常包括一致性、效力、纯度、稳定性和安全性，所有这些都取决于生产和纯化流程。
本文介绍了A549细胞系使用化学限定培养基进行悬浮培养驯化的研究，通过溶瘤腺病毒的产生验证，培养基血清添加的量显著减少到1% (v/v)。此外，还通过感染性颗粒估计和病毒基因组:感染性颗粒比率计算方式，评估了病毒滴度和产品质量。这种细胞系驯化方法是一个强大的工具，可用于加速溶瘤病毒生物工艺向一个更有效且经济的平台方向发展。
详细的实验操作和结果，请参考原文。
图1. A)贴壁和B)悬浮系统细胞驯化过程中执行的顺序策略示意图。
图2. 从贴壁转向悬浮培养后，在CDM4HEK293培养基(•)和HyCell Transfx-H培养基(▴)内驯化过程中的细胞生长趋势。B)初始培养基中未驯化细胞(左)和最终适应培养基中驯化细胞(右)的示意图。
图3. A)已驯化A549细胞系在搅拌槽生物反应器、CDM4HEK239基培养基(添加1%胎牛血清、6 mm谷氨酰胺、5% (v/v) Cell Boost以及10%前次传代条件培养基)中的生长情况。B)评估感染颗粒(IP/mL)和病毒基因组(VG/mL)的产量。利用基于CDM4HEK293的培养基，以MOI 10感染溶瘤腺病毒。C)以驯化的A549细胞系产生的溶瘤腺病毒(未纯化)的透射电镜观察图。(hpi-感染后小时)。
总结：溶瘤腺病毒因其对肿瘤的选择性而成为一种很有前途的肿瘤治疗药物，但贴壁培养的规模放大是这些癌症治疗药物工艺发展中的一个主要瓶颈。在此，我们报道了A549细胞系在商品化的CDM4HEK293培养基中的悬浮驯化，以促进大规模生产。这项工作表明，在更具挑战性的细胞系中，早期引入ST生物反应器有助于缩短驯化过程的时间。随后，研究使用A549悬浮细胞成功地进行了溶瘤腺病毒的生产，其单位体积滴度与此前文献中报道的结果相似。
悬浮培养在生产用于肿瘤治疗的溶瘤病毒方面可以提供多种优势，可以优化纯化过程，从而降低相关成本。总的来说，该平台是生物工艺发展的新策略，特别是细胞系对悬浮培养的适应，可以加快新的溶瘤性肿瘤疗法的临床转化。
原文：A.S.Moreira, A.C.Silva, M.F.Q.Sousa, et al., Establishing Suspension Cell Cultures for Improved Manufacturing of Oncolytic Adenovirus. Biotechnology Journal, 2020, DOI: 10.1002/biot.201900411.