连续生物工艺：灌流生物反应器
当前生物工艺操作主要以批次模式进行，但是对生物生产成本的顾虑以及对提高生产灵活性的需要，使行业对探索连续生物工艺潜力的兴趣日益增加，包括特定步骤的连接或者"端到端"的完全连续工艺流程，即期间，产品从前一步到下一个之间没有显著的中间储存步骤。从原理上看，连续生物工艺可以：
显著降低设施占地和设备成本
显著提高产率（因为所有设备一直都在使用当中）
更高的灵活性（由于设施更高效的利用率）
更优化的产物质量（由于稳态操作）
在复杂生物制品的生产中，提高产品质量的潜力至关重要。相比批次系统，连续工艺具有更短、更均一的滞留时间分布，可降低糖基化水平、脱酰基作用的差异性以及蛋白质聚集水平。美国药物评估和研究中心(CDER)主任Janet Woodcock明确指出，连续生产是药物生产现代化的重要一步。
此外，生物制药厂商在降低生物药价格方面面临着越来越大的压力，这既是为了应对不断提高的医疗保健总成本，也是为了提高新型治疗药物在发展中国家的可用性。此外，生产成本更低的制造商正在加大与老牌生物制药公司的竞争，特别是非专利生物分子(通常称为生物仿制药)的生产。Walthe等估计，对于单克隆抗体产品，整合式连续生物生产工艺的成本将比传统批次生产工艺低55%。Hammerschmidt等人的报告显示，对于非抗体产品，在运营成本和资金成本方面的降幅更大，分别可达5倍和3倍。连续工艺还可以增强设计用于多种产品生产的生产设施的灵活性，使企业能够更有效地管理产品组合，以应对需求的快速变化。
使用灌流生物反应器的连续细胞培养技术是在三十多年前发展起来的。灌流生物反应器的运行需要不断添加营养物质，同时不断去除产物(以及可溶性杂质)，并周期性废弃多余细胞/细胞碎片，以保持几乎恒定的生物反应器体积和细胞密度。在这些系统中短暂的滞留时间对生产高度不稳定的产物特别有吸引力，因为这些产物容易在生物反应器中降解、聚集和/或蛋白水解。灌流系统的细胞密度可以比典型的补料分批生物反应器高出近10倍，从而提高生产效率。用于单克隆抗体(mAb)生产的灌流生物反应器已经良好建立。
因为需要将截留的细胞返回至灌流生物反应器中，对澄清步骤的选择造成了很大的挑战，因为生物反应器的长期运行需要保持高细胞活性。因此，离心和深层过滤作为补料分批工艺中初步澄清的主要方法，很少用于连续生物反应器。相反，细胞循环和澄清通常使用内径(ID)相对较大的中空纤维切向流过滤(TFF)膜组件进行。含有截留细胞的回流液直接返回到生物反应器，而含有分泌产物的滤液透过膜收获，以进行后续的纯化。操作通常在恒定滤液流速条件下进行。
最近的很多研究工作主要集中在膜/工艺的开发上，以减少膜污染的程度，最大限度地降低产物截留，从而使用单根组件进行数周的运行，而不需要清洗或更换。尽管在工艺开始阶段，抗体通过微滤膜的传质可达到100%，但多项研究证实，在运行过程中，产物截留会显著提高。Wang等研究表明，“产品筛分”与细胞碎片导致的膜污染有关，其粒径大约是100nm (仅稍小于200nm膜孔径)。与使用蠕动泵的传统TFF系统相比，使用低剪切离心泵可以降低这种碎片的产生。也有研究显示，在生物反应器中用于减少泡沫的消泡剂所形成的微胶粒也会造成膜污染。
以使用0.2μm 聚砜和2-10μm聚乙烯中空纤维膜的TFF和ATF组件进行CHO细胞灌流培养时的抗体传质（滤液和生物反应器中mAB浓度的比例）
Pinto等评估了在生产单克隆抗体的CHO细胞灌流生物反应器的TFF系统运行期间，膜聚合物和孔径对污染和产物截留的影响。多种0.2μm孔径膜获得了类似的性能，而与混合纤维素酯相比，聚砜、聚醚砜和改性聚醚砜的产物截留率略低。使用大孔径(1-4μm孔径)的聚乙烯膜可显著降低污染，并可稳定运行(接近100%的产物透过) 3周以上。不过，这些大孔径膜获得的滤液更为浑浊，需要通过深层过滤处理，以避免堵塞随后的层析柱。
许多研究表明，采用交替式切向流(ATF)可以显著提高灌流生物反应器使用的TFF工艺的性能。ATF通常使用内径较大的中空纤维膜，但流体由隔膜泵交替泵入组件，即隔膜泵以循环方式将细胞抽离并返回到生物反应器，一次循环的时间通常约为1分钟。这可最大限度地降低高剪切蠕动泵对细胞造成的损伤，并且，交替的液流方向可以“清除”在纤维入口被细胞或细胞碎片堵塞的膜孔。过滤在两个液流方向条件下均可发生，即加压和排气循环期间。此外，ATF系统与生物反应器只需要单根连接管路，这有助于保持无菌性，便于组件更换。ATF已经非常成功地应用于细胞扩增 (如N-2或N-1生物反应器灌流，而N为用于生产的生物反应器)。
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ATF系统通常在非常低的滤液通量条件下运行，通常约为0.3 – 2μm/s (1-5 LMH)，进样流速(进样流速按膜表面积标准化) 约为300 - 800 LMH。低滤液通量、高进样流速 (一般剪切率为1000- 5000 s-1)以及高膜渗透性的结合，可在组件中形成椋鸟巡回式液流，而较大的轴向压降可在回流出口附近形成反向流动。这种反向冲洗可以清洗大部分的膜段，因为液流方向转换的过程中，会将反向冲洗的位置从组件的一端逐步转移到另一端。
切向流过滤（TFF）和交替式切向流过滤（ATF）操作示意图。
已有多项研究表明，与相应的TFF系统相比，ATF操作中的污染和产物截留率明显更低。与灌流生物反应器直接整合的ATF系统可连续运行几个星期。Walther等研究表明，在操作中，如果设置的组件内滞留时间过长，会导致细胞生长速率和产率下降，而提高循环流速，即流体动力应激，会导致细胞大小和细胞特异性产率下降。当滤液流速高于0.7 μm/s (2.5 LMH) 时，膜污染更为显著。使用较大孔径的膜，可以进一步提高性能；Wang 等使用孔径2-10μm的聚乙烯中空纤维聚膜(Spectrum，现为Repligen子公司)进行操作时，运行稳定，且无抗体截留。
原文：A.L.Zydney, New developments in membranes for bioprocessing – A review. Journal of Membrane Science, 2020, https://doi.org/10.1016/j.memsci.2020.118804.