高密度细胞培养策略，优化的可放大性
简介
高密度培养(>40×106 cells/mL)策略可缩短工艺时间，包括灌流、浓缩补料分批以及强化的种子扩增链，而N-1灌流生物反应器用于接种生产生物反应器。在本研究中，使用ThermoScientific™ HyPerforma™一次性使用生物反应器交钥匙系统 (Single-Use Bioreactor Turnkey，S.U.B. TK)整合XCell™ ATF 6灌流系统，实现高密度培养，且无需对标准部件进行修改。HyPerforma S.U.B. TK和ATF 6系统的整合可用于高密度种子扩增或作为生产罐系统。使用标准部件生成了可放大性标准。
目标
本研究中，在生物反应器和ATF灌流的整合系统上，探索了高密度培养、理论规模放大、整合障碍以及高密度培养对生长和工艺参数的影响。
材料和方法
连接ATF6的50L S.U.B. TK系统
连接ATF2的3L Applikon台式生物反应器系统
ATCCTM CRL-12445TM CHO-DP-12克隆#1934细胞，适应LONGTM R3 IGF-1生长因子
培养于GibcoTM CD OptiCHOTM AGTTM 培养基，含100 ng /mL LONGTM R3IGF-1和4mm GibcoTM GlutaMAXTM添加物
细胞以4×105 cells/mL的密度接种至S.U.B.
S.U.B.的操作条件列于表1
ATF6系统的操作条件列于表2
表1. 生物反应器操作条件
表2. ATF条件
结果
细胞生长
在所有细胞运行中，都获得了>4×106 cells/mL的活细胞密度以及相似的生长速率和活性(图1)。在两次50 L运行中，活性都保持在88%以上，而在台式反应器中，第11天的活性降低至约80%。根据生长速率和目标细胞密度，50 L运行进行恒定的细胞废弃，而在3 L生物反应器上进行“脉冲式”细胞废弃。
图1. 50L和3L生物反应器的活性和活细胞密度
蛋白质生产
50 L和3 L生物反应器之间及ATF系统内的蛋白质浓度相似 (图2)。滤液中的IgG浓度低于反应器，推测是由于0.2μm孔径膜的截留或管路内的蛋白质吸附所致。
图2. 50 L和3 L生物反应器内的IgG生产
每升工作体积的标准化累积蛋白质vs. 每升活细胞计数积分(IVCC/L)呈现几乎相同的斜率，说明具有相似的蛋白质生产速率（图3）。
图3. 50 L和3 L生物反应器中的总累积蛋白质 vs. IVCC
氧气流速
对于两次50 L细胞运行，使用控制器记录氧气流量数据，并针对活细胞密度(VCD)绘图(图4)。生物反应器之间的氧气需求几乎相同，氧气需求和活细胞密度之间有明确的相关性。此前的测试表明，Thermo Scientific™钻孔鼓泡(DHS)的鼓气量与体积传质系数(kLa)之间存在线性关系。对于50 L生物反应器，鼓泡也保持在推荐的0.1 VVM气体流量范围内。
图4. 50 L和3 L生物反应器之间的氧气流速和活细胞密度（VCD）
讨论
系统整合
AseptiQuik™ X接头为高压灭菌后ATF6系统与S.U.B.的连接提供了简单而快速的方式。S.U.B.在下部探针带为ATF系统提供了一个进样端口，可通过AseptiQuik X接头连接至反应器(图5)。两次50 L运行中，当以较低的压力和流速（12 L/min）进行操作时，均没有观察到泄漏情况。
图5. 50 L 一次性使用生物反应器通过AseptiQuik X接头连接至ATF 6灌流系统
规模放大标准
基于恒定剪切的S.U.B.和ATF系统的规模放大标准如图3所示，在更小规模条件下进行的独立测试也显示了相似的条件。
通过单根1” 管路和AseptiQuikX接头进行系统连接，可尽可能地降低与1000L规模反应器连接时，流速导致的压力增大。为了进一步降低流速和压力增加，对于2,000L规模反应器，S.U.B和ATF系统之间需要两个并行连接。对于需要特定的操作条件的50L-1,000L规模，也可以考虑相似的配置。
DHS的纯氧鼓气能够在所有S.U.B.尺寸中实现>60/小时kLa，以支持高达100 x 106 cells/mL的高细胞密度培养(数据未显示)，而不需要单独的微泡。
表3. 在1.5 VVD滤液流速条件下，S.U.B.和ATF系统的规模放大标准
总结
在2 VVD的流速条件下，50 LS.U.B.和3 L生物反应器都达到了>40 x 106cells/mL的稳定细胞密度
由于葡萄糖消耗，细胞生长受限；细胞生长不全依赖于生物反应器和ATF系统性能
两次50 L细胞运行的蛋白质生产速率相同，表明性能相当
钻孔鼓泡在50 L S.U.B.中能够满足氧气需求，可作为独立鼓泡用于大多数高密度细胞培养
系统规模放大基于恒定ATF剪切，使用商品化可用过滤器
相比台式规模测试，消泡剂需求相对较低
本文内容、图片、表格均源于文章“High-density culture strategies for improved scalability For single-use systems”，由于水平有限，如有任何问题，请点击左下角“阅读原文”，查看原文链接。