从研发到中试/生产：细胞培养工艺如何有效地进行放大

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作者：解正刚 

Eppendorf中国生物工艺部门

” 随着抗体药物领域的高速发展，动物细胞培养工艺也在不断的更新和优化，培养规模更是从早期的百升级别扩大到万升级别。抗体药物的生产工艺如果从细胞复苏开始计算，细胞不断培养和扩增阶段占据了整个流程的大部分时间。因此，细胞培养工艺的优劣是抗体生产中最关键的因素之一。

抗体药物通过QbD的方法进行生产上游工艺的开发，利用实验设计（DoE）和高通量平行生物反应器等技术、设备的优势，高效的完成抗体实验室规模的研发工艺，尽早了解产品关键质量属性（CAQs）和关键工艺参数（CPP）之间的关系，以及确定研发工艺中的设计空间（Design Space）。一旦完成这些小规模研发工艺后，接下来就需要进行工艺的放大。理想情况下，高效的工艺放大能在2-4个月内完成从研发规模到中试/生产规模的过渡。如何实现高效的工艺转移和放大，是对整个工艺技术团队经验和水平严峻的考验。

工艺放大的目标是在细胞培养规模逐渐扩大的情况下，保证细胞在相对恒定的环境中稳定的生长以进行产物的表达。衡量的标准包括细胞密度、生长速率、活率、产物表达率和糖基化水平等多方面。在细胞培养工艺的放大过程中关键控制参数会分为两种类型。一种是和体积无关的，例如温度、DO和pH等。另一种是受体积和几何尺寸影响的，例如搅拌速度和通气流量等。由于在研发阶段使用的罐体供应商多种多样，罐体的材质（一次性或玻璃）、高径比、搅拌桨直径和罐径比以及放大后使用的罐体一般都不完全一致；甚至同一供应商不同体积的罐体也不能做到等比例尺寸放大。这就给放大后搅拌、通气等参数的确定带来很大的挑战。为保持培养环境的一致性，开发人员通常会采用以下几种放大准则。

1. 恒定叶端速度（Tip Speed）

细胞培养工艺中，搅拌桨剪切力是需要考虑的重要因素之一。不同的工程细胞株对剪切力的耐受能力不同。早期CHO细胞耐受的剪切力较低，现阶段的工程细胞株对剪切力的耐受得到很大的提升。剪切力往往通过叶端速度来体现。搅拌桨直径和转速决定叶端速度的大小。由于罐体设计的需要，罐体体积的增加，搅拌桨直径也会增加。因此恒定叶端速度的模式下，大体积罐体的搅拌速度要低于小体积。恒定叶端速度的放大可以让细胞在同样的剪切力环境下生长。这种放大策略适用于小规模的放大和生产。

2. 恒定混匀时间（Mixing time）

混匀时间是比较简单的一个放大准则。尤其在化工行业，混匀时间的恒定可以直接作为放大的依据。但在细胞培养工艺中，小规模（如2L以下）体积可以很快达到混匀时间，而大体积则需要更高的叶端速度才能达到混匀时间。这就会导致剪切力的提高，造成细胞的损伤。

3. 恒定K_La

K_La是表征氧气从气相进入到液相的速率。反应器中合适的K_La是工艺放大的关键，O₂作为细胞的重要营养物质，影响细胞的正常生长及代谢。恒定的KLa放大准则给细胞提供了相同的氧传递环境。但K_La的测定受很多因素影响。例如培养过程中搅拌速度、通气流量等，需要很多测试和分析来确定合适的K_La。在实际操作过程中，K_La随着工作体积的增加而增加。当达到一定体积后，K_La CO₂又会和K_La相互影响，提高了K_La恒定放大难度。

不同叶端速度和气体流量下Eppendorf BLU 0.3L到50L的K_La

4. 恒定单位体积功耗比（P/V）

P/V和搅拌功率（Np，Power Number）、罐体直径、搅拌桨直径、工作体积、液体密度等很多因素有关，一定程度上体现了混合程度，影响培养体系的混合和传质。因此恒定P/V被推荐为很多工艺放大的准则，是当前最常采用的放大策略。考虑到细胞剪切力的耐受性不同，常见的P/V范围在10-40 W/m³。

影响P/V值的诸多因素 

除以上4个放大依据外，放大到一定体积的规模时，还需要考虑pCO₂对细胞生长和蛋白表达的负面影响。小体积培养时，由于通入的气体在上升过程中可以带走大部分细胞代谢产生的CO₂，基本不用考虑CO₂去除（CO₂ Stripping）。而大体积培养中， k_La CO₂随着反应器规模的扩大降低，即CO₂去除能力降低。体系中气体饱和度和气泡量直接影响CO₂去除，提高通气量及气泡停留时间可以加快移除。部分反应器供应商将CO₂去除功能整合进控制系统，方便对pCO₂的控制。

Eppendorf BioFlo 720 气体控制界面（“CO₂↓”为CO₂去除功能 ）

无论哪一种放大策略，在使用过程中都会涉及搅拌速度、通气流量等在不同工作体积下的换算。这需要耗费开发人员大量的时间和精力。以Eppendorf BioFlo 720和320系列为代表的生物反应器控制系统，为减少工艺开发中恒定叶端速度和恒定P/V策略的参数换算，直接加入放大助手（Scale-up Assist）软件。该软件数据库包含了Eppendorf系列所有罐体体积，以及Thermo Fisher 50L到2000L的一次性罐体（S.U.B.，Single Use Bioreactor）的相关叶端速度、P/V值和对应搅拌、气体流量等的关系。同时也可以自定义输入其他供应商的参数，用于相互换算。这样的设计，减少了单一供应商或者多品牌供应商在罐体参数换算过程中的 技术障碍，极大地简化了用户在Scale-up，甚至Scale-down开发中的工艺流程。

Eppendorf BioFlo 720 放大助手（Scale-up Assist）功能

抗体工艺技术的不断提升，工艺放大面临的挑战也在不断变化。很多时候需要工艺开发人员根据细胞株特性的不同、表达的产物的不同灵活的调整放大工艺。更多的时候会综合考虑P/V、叶端速度、CO₂去除等多种因素，在确保CQAs的情况下，得到最佳的放大生产工艺。

了解“从摇瓶到一次性罐体的放大”案例，以及更多BioFlo 720 信息，请点击下方中文字幕视频和文献链接。

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