双特异性抗体生产的收获和纯化工艺

本文节选自《Recovery and Purification Processing for Bispecific Antibody Production》，详细内容，请参考原文。

介绍

生物药领域正在向更具创新性、功能增强的“配置”演变，其中双特异性抗体(BsAbs)构成了下一代关键的免疫肿瘤治疗方法。BsAbs靶向以单个分子靶向多个抗原，以增加肿瘤选择性，从而促进免疫细胞招募到肿瘤细胞。这种独特的分子结构获得了广泛的应用，包括阻断不同的信号通路、双重靶向不同的疾病介体，并将有效载荷输送到目标位点。自从BsAbs最初被介绍以来，有超过100个BsAbs要么目前已经市场上，要么正在开发中。

BsAbs的主要形式可分为IgG样和非IgG样。IgG样BsAbs保留Fc区域的全部功能，从而参与免疫效应功能，并具有提高血清半衰期和稳定性的优势。建立在双特异性结构上的新兴工程方法包括三特异性格式。三特异性可以结合和参与自然杀伤细胞(NK)与T细胞和B细胞激活或加强T细胞激活以增强效力。

最初，双特异性抗体是利用杂交瘤技术或还原和再氧化来偶联在不同细胞类型中表达的两种不同抗体的抗原结合片段(Fabs)生产的。然而，这类合成的BsAbs由于错配而导致产量较低，从而导致下游纯化困难。为了克服这些限制并推动异质二聚体的形成，蛋白质工程已经取得了许多进展。这些包括重链(HC)空间工程，如旋塞孔(KiH)技术和静电相互作用，常见轻链(LC)制造以及CrossMab策略，以防止错误关联。随着抗体工程技术的这些改进，目前大多数治疗性BsAbs是在哺乳动物细胞系中生产的。这允许将类似单克隆抗体/蛋白纯化的技术，包括深层过滤、层析和膜过滤，应用于药物底物(DS)的生产。因此，下游工艺和生产控制在确保BsAbs产品的安全性、质量、纯度和有效性方面发挥了关键作用，从而满足临床试验和商业化的监管要求。

双特异性抗体纯化概述

与单特异性抗体相比，双特异性抗体虽然具有更强的功能性和更强的安全性，但在这些分子的下游纯化工艺中出现了独特的挑战。由于BsAbs结构的复杂性，许多错配物质的组合可能导致阻碍正确的异二聚体结合。然而，即使采用上述的优化工程方法，在细胞培养过程中仍然可以组装形成独特的产物相关异构体。这些表达产物池中的产物相关杂质包括游离HC、LC、同型二聚体、半分子和其它错误配对HC/LC物质，在开发生产BsAbs的下游工艺时必须清除和控制这些杂质。然而，双特异性形式不断增加的复杂性导致了更多潜在的与产物相关的物质的形成，并需要一个强大的下游工艺流来清除这些额外的“杂质”。层析操作是通过去除工艺和产物相关的杂质而有选择地纯化BsAbs的首选技术。亲和纯化是应用于生物技术行业最有价值的层析操作之一。结合Fc的蛋白A/G/L、KappaFabSelect和LamdaFabselect，或分别用Kappa和LamdaFab进行IgG样BsAbs的亲和纯化。

对于大多数BsAbs，一个亲和捕获层析步骤(通常是Protein A)不足以达到临床研究所需的纯度，并且产物相关的异构体(游离HC、LC、同型二聚体、半分子和其它错配HC/LC物质)不能从BsAb中分离出来。此外，根据Protein A配基的特性，含有结合区的异构体物质可以影响结合并强烈影响洗脱参数。其它层析策略，如离子交换(IEX)、疏水相互作用层析(HIC) 、尺寸排阻层析(SEC)和混合模式或多模式(MM)层析已被用于进一步分离产物相关异构体，用于小规模物料的制备。

尽管这些不同的层析工具可以在线性梯度洗脱条件下实现高BsAb纯度，但开发符合严格法规要求的经济性下游工艺平台仍然是一个重大挑战。在亲和捕获步骤之后，精制步骤需要比典型单抗更多的开发工作，因为有无数的工艺相关杂质需要去除。在这里，我们介绍一个强大的下游平台，它可以有效地为三种不同的IgG 样双特异性分子制备高质量的药物底物，尽管三者有不同的形式。这些产物包括IgG(1+ 1)、(2 + 1)和单链可变片段(scFv)形式，用结合位点的数量表示。

双特异性抗体的平台纯化工艺

在生物技术行业，使用平台方法进行单抗纯化有几个优势，包括快速早期工艺开发以及资源和成本的节约，特别是在原材料采购、技术转让、分析开发和监管申报方面。然而，由于上述原因，可以覆盖各种BsAbs形式和结构应用的下游BsAbs平台工艺还没有报道。我们开发了一个IgG样BsAbs的下游纯化平台，并应用于三种不同的BsAb分子。这大大减少了开发时间，并为我们管线中的BsAbs产物的早期开发节省了成本。

BsAbs下游平台工艺包括使用深层过滤的收获/澄清、亲和捕获层析之后的低pH病毒灭活、随后的两个精制层析步骤、除病毒过滤、超滤/洗滤(UF/DF)和最终的药物底物过滤和灌装步骤，如图1所示。该下游平台工艺提供了针对产物相关杂质的有效分离过程，包括残留宿主细胞DNA和宿主细胞蛋白(HCP)以及高分子量(HMW)和低分子量(LMW)杂质。它还显示了良好的病毒清除能力、灵活性和可生产性。更重要的是，该平台维持了典型的单抗平台的工艺流程，从而可实现简单的工厂适配，并在生产规模上实现多产品协调。

收获澄清

下游BsAbs平台工艺的第一步是从细胞培养液中回收BsAbs，清除细胞、细胞碎片以及其它与工艺和产物相关的杂质，如DNA、脂类、低分子量物质等。与单抗收获澄清工艺类似，在层析纯化步骤之前，使用深层过滤可以得到澄清的细胞培养上清液。三个过滤阶段包括初级(大孔径范围的深层过滤器)，二级(更紧致、更小孔径范围的深层过滤器)以及三级除菌微滤(0.45/0.2 um)阶段，操作可将可溶性产物从较大的、不溶性细胞和细胞碎片中分离出来。对于2000L或更高体积的批次生产，可以采用碟片式连续流离心结合深层过滤的方式。针对每个BsAb产品，需要对深层过滤的基质、孔径、电荷特性和载量进行评估。表1比较了三种不同形式的BsAb分子在实验室和中试规模中的澄清产量。相似的深层过滤序列被用于所有三种BsAbs。深层过滤获得的澄清细胞培养上清液的滴度比生物反应器内细胞培养液离心获得的滴度要低，这可能是由于去除了一些与BsAb产物相关的异构体物质以及缓冲液导致的稀释。每种BsAb的步骤收率各不相同，这可能是由于深层过滤器规格和基质的不同所致，但在不同的规模条件下，可获得总体令人满意且一致的结果。

亲和及精制层析

澄清后，在这个平台工艺中使用Protein A亲和柱作为捕获步骤，从工艺和产物相关杂质中分离目标双特异性分子。在中性pH条件的典型生产生物反应器细胞培养条件下，BsAb和包含Fc部分(HC、同型二聚体、半分子和3/4BsAb)的产物相关物质会与Protein A柱结合，用低pH洗脱缓冲液共洗脱，工艺相关杂质(宿主DNA和HCP)以及不含Fc的产物相关杂质流过层析柱。一些非特异性的弱结合物质，如LC和Fab，也可能与BsAb形成非共价结合并一起洗脱(数据未显示)。然而，由于非理想的填料结合载量会对Protein A的洗脱收率和纯度产生负面影响，因此需要开发工作来优化上样载量，以最大限度地提高每种BsAb抗体的步骤收率和产物纯度。此外，在BsAb2中发现scFv会和三链BsAbs形成聚体，而洗脱缓冲液pH筛选可以优化产量并使聚体的水平最小化，如果聚体含量过高，会对精制层析纯化造成不小的挑战。如表2所示，在相似的Protein A层析条件下，步骤收率相当，范围为81 - 94%。Protein A洗脱池的SEC主峰纯度变化范围为49 - 98%，CE-SDS非还原(NR)主峰纯度变化范围为56 - 94%，这主要是由于不同的BsAbs形式、结构和稳定性。特别是，BsAb1和BsAb2具有较高的低分子量物质水平，这是由于与这些分子相关的独特的产物异构体。在Protein A层析步骤之后，残留的DNA和HCP杂质水平将不再是显著的挑战。

大多数BsAb纯化工艺需要至少两个或两个以上的精制层析步骤，以进一步去除产物相关杂志，包括游离HC、LC、同型二聚体、半分子和其它错配的HC/LC物质 (3/4 BsAb、HC异二聚体)，这些在典型的mAb Protein A洗脱池中通常看不到。对于这些分子来说，这些独特的BsAb产物相关异构体仍然存在问题，一个亲和捕获层析步骤不足以达到临床研究所需的产物质量。结合IEX和MM，在这个BsAb平台工艺中使用了两个精制层析步骤，产物相关杂质，包括半分子，被有效地去除(表2)。对于BsAb1, IEX后，CE-SDS (NR)纯度从71提高到90%，主要得益于半分子、¾ BsAb、游离LC和HC的去除。这些残留的产物异构体可被第二步的MM精制层析进一步去除。BsAb1的最终CE-SDS (NR)纯度为> 97%。对于BsAb3, IEX促进HC、半分子和HC异二聚体物质的进一步去除，随后的MM层析实现了LC、半分子、HC异二聚体和¾BsAb异构体的辅助分离，从而获得了98%的CE-SDS (NR)纯度。同样，在MM和IEX精制层析步骤后，BsAb2的CE-SDS(NR)纯度从56%显著提高到97%。值得注意的是，经过两个精制层析步骤，所有三种BsAbs都达到了高纯度和产物质量要求，可满足临床试验的法规要求。然而，为了达到这个纯度水平的BsAb1和BsAb2，较低的步骤收率是一个折衷，两个精制步骤中的一步(BsAb2)或两个精制步骤(BsAb1)的收率低于60%。此外，内毒素和生物负荷水平都在既定的规格限制内(数据未显示)。

病毒清除

BsAb下游工艺从哺乳动物细胞源性的BsAb产品中去除/灭活内源性和外源性病毒的能力是产品安全保证策略的一个重要组成部分。对于单抗产品，内源性逆转录病毒(异嗜性小鼠白血病病毒(X-MuLV))的典型清除值约为> 12 log10，外源性病毒(小鼠细下病毒(MMV))的典型清除值约为> 6 log10。平台纯化工艺的每个步骤，包括Protein A层析、低pH病毒灭活、两个精制层析步骤以及BsAbs1-3的除病毒过滤，都需评估其清除或灭活病毒挑战的能力。

表3给出了每个步骤的Log降低值(LRV)。每种BsAb的所有纯化工艺步骤都有效清除了MMV和X-MuLV, LRV分别大于6和18 logs。

结论

随着越来越多的双特异性抗体作为新一代抗体疗法进入不同的开发阶段，生物制药公司越来越关注于速度、效率和成本节约。使用下游平台工艺可以在不影响质量和产量的情况下实现快速的早期开发。我们为BsAb生产开发的下游平台工艺，包括三个柱层析步骤，已经证明了对工艺和产物相关杂质的强有力清除、一致的工艺性能、减少开发时间，并节省了主要资源和成本。IEX和MM精制层析在去除与BsAbs相关的新型产物异构体方面非常有效。特别是，MM填料提供了独特的分离能力，可以更好地清除BsAbs相关异构体。

平台工艺和工程技术，包括KiH、CrossMab、电荷异构体操作，以促进HC-HC异二聚化和HC-LC配对，以及优化Protein A的结合性，有助于制备高质量的BsAbs。此外，细胞系开发过程中基于BsAb产品质量的克隆筛选方法，是克服治疗性BsAb生产挑战的补充解决方案。

原文：J.Zheng, J.Walker, S.Ghose, Recovery and Purification Processing for Bispecific Antibody Production. American Pharmaceutical Review, 2021