交替式切向流(ATF)滞留时间、流体动力应激和过滤通量对高密度灌流细胞培养的影响
本文节选自来自Sanofi的研究人员发表的文章《The effects of alternating tangential flow (ATF) residence time, hydrodynamic stress and filtration flux on high-density perfusion cell culture》，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
简介
灌流细胞培养是生物制药行业中一项被长期研究的技术，其相对于补料分批培养的优势包括更长的持续时间和更少的周转操作、更高的细胞密度和产量、培养期间更健康且更均一的环境、以及潜在的更高且更一致的产品质量。而其缺点包括更大的培养基体积、围绕长时间可操作性和无菌性的挑战、更长的开发时间、以及整个行业中已有的大量基于补料分批模式的基础设施。
随着细胞密度和灌流系统产量的增加，连续细胞培养的需求变得更加迫切。经济分析预测，在120x10^6 cells/mL的条件下，相对于补料分批而言，灌流有很强的采用理由。N-1步骤的灌流可以实现高密度接种，消除了生产生物反应器中需要长时间生长才能达到强化目标密度的需要。当然，培养液的细胞密度上限与用于灌流的特定细胞分离技术有关。很多此类依赖于密度分离的方法，例如重力、离心和声学沉降，通常只被证明达到20– 30 x10^6 cells/mL。早期的过滤方法，如旋转滤器，其峰密度通常限制在30x10^6 cells/mL左右，过滤器污染是一个主要限制因素。
然而，在过去的5-10年中，切向流过滤(TFF)和交替式切向流过滤(ATF)方法已经成为打破这些细胞密度阈值的策略。这些方法依靠一个共同的原理来实现即使在高密度条件下也能过滤的需求：通过中空纤维过滤器内较大的切向液流防止细胞和碎片的积累以及污染过滤器，而较小的垂直液流则透过纤维并做为收获物进入下游。这种技术已被证实峰密度可超过100x10^6 cells/mL，而超过40 x 10^6cells/mL的培养可持续较长的时间。如果进一步进行强化，并且这些高密度方法被证明可用于商业化生产，即使是对于传统上使用补料分批式生物反应器生产的稳定分子，灌流也可能成为经济上合理的选择。
我们利用ATF强化生产生物反应器。但随着细胞密度的不断升高，细胞分离装置的局限性最终还是会出现。了解ATF及其对细胞和产物施加的不同应力对于获得设计良好且稳健的工艺至关重要。由于ATF和生物反应器作为一个集成单元运行，因此鉴别ATF的关键参数及其与生物反应器性能的相互作用非常重要，以便为组合单元操作定义一个可接受的总体设计空间。
在本文中，我们综合了之前对ATF相关剪切和过滤污染的研究，并考虑了三个ATF对细胞培养工艺造成潜在影响的因素：(1)细胞在ATF设备内的滞留时间、(2)传输管路和中空纤维内的流体动力应激以及(3)中空纤维过滤器内蛋白质（更具体的说，产物）浓差极化和污染。我们使用经验和理论相结合的方法来探索对这些影响的理解，并为工艺定义安全的操作空间。
材料和方法
ATF (Repligen，Waltham，MA)的示意图如图1所示。该装置底部的隔膜泵交替地抽出细胞培养液，然后将其返回到生物反应器。液体首先通过传输管路，然后通过中空纤维过滤器的内腔进入ATF的泵腔，然后通过相同的路径返回反应器。使用外部泵使无细胞的灌流液垂直地穿过中空纤维。相对于灌流率，这种交替流的置换率较高，产生了显著的反冲，并允许系统在更长的时间内工作，而不会产生过滤器污染。在本文中，我们使用“向下半周”指代从完全充气到完全泄气的隔膜过渡，而“向上半周”指代相反的过程(完全泄气到完全充气)。一个完整的循环包括一个向下半周和一个向上半周。
图1. ATF示意图，置换液流由隔膜泵驱动，将细胞培养液交替式从生物反应器抽出和送回，期间，液流上、下通过中空纤维膜内腔。同时，外置的滤液泵使无细胞的收获液垂直通过过滤器。
我们将搅拌罐生物反应器(Broadley-James，Irvine, CA)与ATF过滤装置结合，培养分泌重组蛋白的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。标准的设置是一个生物反应器，连接到ATF过滤装置，以实现灌流 (补充材料中的图S-1)。接种后，新鲜培养基以恒定速率补加到反应器。无细胞收获物通过ATF以保持生物反应器重量(亦即体积)恒定所需的速率去除。一旦生物反应器达到其目标生产细胞密度，含细胞的培养液以保持细胞密度恒定的速率直接从生物反应器中除去。Aber Futura探头(Aber Instruments, Aberystwyth, UK)测量电容，作为细胞密度的在线指示。在某些情况下，如果电容探针不可用，每天进行细胞废弃，以使培养液接近目标密度。细胞密度通常控制在40 x 10^6 cells/mL左右。
图S-1：生物反应器/ATF示意图，显示如何控制灌流速率、罐重量和细胞密度（通过电容），以维持恒定且有利的环境。
灌流使用化学限定培养基进行 (1 – 2 VVD)，一个细胞系生产重组酶(细胞系A)，两个细胞系生产单克隆抗体(细胞系B和C)。工作体积3.75L和10L的玻璃生物反应器以及工作体积50L的一次性使用生物反应器分别搭配ATF2、ATF4和ATF6。ATF使用纤维内径1mm、孔径0.2μm的聚醚砜(PES)过滤器 (Repligen)。使用鼓泡控制溶氧水平。使用Vi-CELL (Beckman Coulter，Brea，CA)测定活细胞密度和活性，CedexBio HT (Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)测定细胞培养指标，如葡萄糖、乳酸和LDH活性。抗体产物浓度也用Cedex Bio HT测定，而酶产物活性则用内部活性分析方法检测。
ATF滞留时间
细胞在ATF内的滞留时间应尽量缩短，以减少暴露在ATF内不受控制的环境中。滞留时间主要受ATF置换率和ATF死体积(传输管路和过滤器的总体积)的影响。实际的置换率可以不同于输入的置换率设定点，因为隔膜泵的时间是基于一个假定的泵体积，而在现实中，泵体积实际上会随着置换率的增加而增加(因为硅胶隔膜在更高的速率下伸展得更多)。我们用一个简单的比例修正来解释这个问题：
其中，𝑄𝑖𝑛𝑝𝑢𝑡是输入的置换率，𝑄是实际置换率，𝑉𝑝𝑢𝑚𝑝,0是假定的泵体积，𝑉𝑝𝑢𝑚𝑝是实际的、经验测量的泵体积，对应于𝑄𝑖𝑛𝑝𝑢𝑡。
关于在ATF内长时间滞留的主要问题是氧的可用性。我们可以通过将氧浓度除以耗氧率来估算ATF中溶氧耗尽的时间：
其中𝑡𝑑𝑒𝑝𝑙𝑒𝑡𝑒氧气耗尽的时间，𝑐𝑂2是空气环境中细胞培养液内氧气的摩尔溶解度，𝑓𝑂2是反应器内控制溶氧水平 (值为1即对应最大溶解度，溶氧设定值的100%)，𝑞𝑂2为细胞特异性摩尔氧摄取率，𝑥𝑣为活细胞密度。氧的摩尔溶解度可以使用Setchenow和van't Hoff公式的组合来估计。
接下来，我们必须估计细胞在ATF中的滞留时间，并将其与氧气耗尽时间进行比较。为了得到近似值，我们做了几个初步假设：(1)传输管路和中空纤维中的流体以不随径向位置变化的平均速度移动；(2)传输管路和中空纤维中的轴向混合可以忽略不计；(3)在每一个向下半周结束时，ATF泵腔内可达到完美的混合；(4)在一个循环内转入ATF的所有细胞都在ATF内度过整个向下半周 (图2A)。
图2. 针对（A）列于公式3-6的简化方法和（B）Monte Carlo方法的ATF循环假设。
图S-2：传输管路、过滤器、泵腔（bulb）和泵体积示意图。
有了这些假设，我们观察到，在向下半周结束时位于传输管路或过滤器末端的细胞将在向上半周开始时立即返回到生物反应器，因此在ATF中的滞留时间可以忽略不计。然而，在向下半周到达泵腔的细胞有可能在几个循环内仍保持在ATF内，特别是当死体积与泵体积之比增加时。为了估算在ATF系统中的滞留时间，我们首先计算每个循环后与新鲜生物反应器培养液置换的泵腔体积的比例，如下：
其中𝑓𝑒𝑥𝑐ℎ为与新鲜生物反应器培养液置换的泵腔体积比例 (即置换比例)，𝑉𝑝𝑢𝑚𝑝、𝑉𝑥𝑓𝑒𝑟、𝑉𝑓𝑖𝑙𝑡𝑒𝑟、𝑉𝑏𝑢𝑙𝑏分别为ATF泵、传输管路、过滤器、泵腔体积。(这些体积定义的示意图参见补充材料中的图S-2。) 公式3表明，料液只能返回到生物反应器中(并被置换)，前提是泵送体积要大于过滤器和传输管路中的死体积。接下来，我们可以使用公式计算一个细胞在给定循环数内在ATF泵腔中被捕获的概率：
其中𝑝是一个细胞在ATF中滞留𝑛个循环的概率。使用公式4中的概率分布可以计算ATF中一个细胞滞留的平均循环数。这个加权平均是一个幂级数，收敛于𝑓𝑒𝑥𝑐ℎ的倒数：
在0≤𝑓𝑒𝑥𝑐ℎ≤1。平均滞留时间可以用以下简单公式确定：
其中𝜏为ATF系统的平均滞留时间，𝑡𝑐𝑦𝑐𝑙𝑒为ATF循环时间：
需要注意的是，大多数以往的ATF滞留时间计算假设整个ATF系统混合良好。在此假设下，每个循环后系统返回到生物反应器的比例可以用以下公式计算：
利用公式4-6，可以计算出滞留时间分布和平均滞留时间。然而，这种方法极大地降低了滞留时间的计算，并可能低估死体积的影响，这就是为什么我们提倡使用仅一个混合良好的泵腔的假设以及公式3中由此产生的置换比例公式。
在公式6中，建立滞留时间近似值的一些假设是不准确的，可以改进。特别是，过滤器中的中空纤维直径足够小，以至于可以假设流动是层流的，这就可获得可忽略的径向混合以及取决于径向位置的轴向速度。此外，ATF液流并不是在每个循环的开始和结束时立即出现，而是相当均匀地分布在整个循环过程中 (如图2B所示)。我们可以通过模拟到达ATF的随机颗粒，并将这些模拟结合到Monte Carlo方法来获得滞留时间分布和平均滞留时间，从而将这些额外的细化纳入改进的滞留时间计算中。(参见补充材料中图S-3针对模拟方法的流程图和公式的说明)。输出为平均滞留时间和滞留时间分布。模拟是使用Python编程语言编写和执行的。
我们应用简化模型(方程3-7)和Monte Carlo模型(图S-3)来估计之前在不同细胞系和规模上进行的多次实际灌流生物反应器运行中的ATF滞留时间。这些滞留时间与运行成功性相关，运行成功定性地定义为当培养液长时间保持在目标细胞密度(通过细胞废弃)时，系统保持正表观增长率的能力。
ATF中的流体动力应激
能量耗散率(EDR)被认为是预测系统中细胞损伤的一种好方法。由于通过ATF的高置换率，通过传输管路和中空纤维的细胞可能会经历高水平的剪切，从而对培养产生负面影响。
首先，我们可以通过计算设备不同区域的Reynolds数(𝑅𝑒)来计算传输管路和中空纤维腔内的EDR。对于𝑅𝑒小于2100的区域，我们可以假设为Hagen-Pouseille层流，在这种情况下，EDR在半径上的变化如下所示：
其中𝜖为EDR，𝜇为流体的粘度，𝑣为流体的平均流速，𝑅为管的半径，𝑟为管内径向位置。最大EDR发生在管壁，平均EDR是最大EDR的一半。(注意，对Mollet的原始公式进行了替换，因此公式9基于流速而不是体积流量。)
当𝑅𝑒大于4000时，可以假设为湍流。为了在这种流动状态下获得具有光滑表面(如硅胶)的管内EDR，首先必须计算Fanning摩擦因数：
管状系统的体积EDR (由于摩擦) 是压降和体积流量除以考虑的体积的结果：
其中𝑄是通过管道的体积流量，𝑉是管道在𝐿长度上的体积，𝐴是管道的横截面积，Δ𝑃𝐿是管道在𝐿长度上的压降。压降可以用摩擦系数计算：
结合公式11和12，我们可以得出湍流中EDR的表达公式：
为了进行本研究中的模拟目的，我们假设传输管路内为湍流，中空纤维内为层流。(这通常是正确的，但需要注意的是，对于一些低置换率和大直径管路的组合，在传输管道中确实存在层流。) 因此，公式9和13使我们能够计算细胞在过滤器和传输管路内经历的“瞬时”EDR。我们还假设ATF泵腔中的EDR可以忽略不计。为了更全面地了解细胞在每次进入ATF时所经历的EDR，我们可以将上一节提到的MonteCarlo方法与EDR计算结合起来。在每次Monte Carlo模拟中，我们跟踪颗粒进入ATF后的位置、持续时间和EDR。有了这个框架，我们可以生成ATF系统中细胞经历的EDR的累积分布。
为了将这一理论方法与实验数据相结合，我们还在实验室规模生物反应器中进行了单变量ATF4研究，在该实验中，置换率在2-8 L/min范围内变化，并监测细胞响应(生长、代谢和产量)。在运行结束时，置换率恢复到原来的值，以确认滞后效应最小。这些研究提供的信息可以解释细胞培养如何响应ATF中的剪切。
ATF过滤器污染
两个重复生物反应器/ATF系统在不同的过滤通量下运行，测量通过过滤器的蛋白质筛分，以测量对过滤器污染的影响。为了了解ATF规模对过滤器污染的影响，生物反应器与ATF2和ATF4连接(两者同时运行)。细胞密度控制在40x 10^6 cells/mL左右。选择每个ATF的过滤速率，使过滤器通量(单位过滤器表面积的体积流量)在不同ATF规模上保持相等。为了确保生物反应器中的细胞在整个实验过程中经历相同的环境，总灌流速率维持为2 VVD。在较高的过滤通量下，使用无细胞的循环回路将一部分ATF4收获液返回至反应器来实现此目的。(操作示意图见补充材料图S-4)。ATF2和ATF4的置换率分别保持在1和3.5L/min不变。在一次灌流运行中，连续研究了5种不同的过滤通量。在第3种通量条件后更换ATF，以避免过度污染。每种通量条件维持5-20天，在此期间，计算两种蛋白质(产物和乳酸脱氢酶)的筛分系数，计算公式如下：
其中𝜎为筛分系数，𝑐ℎ为收获液中的(ATF后)蛋白质浓度(或活性)，𝑐𝑟为生物反应器中(ATF前)蛋白质浓度(或活性)。筛分系数被认为是ATF过滤器污染的主要指标：接近1的筛分系数表示过滤器干净、无污染，而筛分系数为零表示没有产物分子能通过过滤器。
为了比较不同的生物反应器/ATF条件，我们检测了每种条件随时间变化的筛分系数，并计算和比较了每种组合的最佳拟合线的斜率。这些斜率表示不同条件下的过滤器污染率。
为了验证过滤器历史没有混淆过滤器污染率检测，我们计算了过滤器随时间的理论暴露值，作为统计分析中的另一个可能因素：
其中𝐸为暴露量，𝑗为时间t时的过滤器体积通量，𝑐𝑟为生物反应器中的蛋白质浓度，该浓度指示生物反应器对过滤器的总负荷。我们同时使用LDH和产物来计算暴露量，并针对离散时间点采用梯形法计算公式15中的积分。
JMP (SAS Institute, Cary, NC)编制并分析了包含分类因素(ATF类型、生物反应器重复)、连续因素(过滤通量、暴露)和响应(LDH和产物筛分系数变化率)的数据表，以了解哪些因素在统计和实际意义上有显著性。我们使用逐步回归，并使用𝑝-值阈值停止规则 (输入0.1，离开0.05)。
结果和讨论
ATF滞留时间
ATF相关问题最初是在比较4L/ATF2和10L/ATF4系统中的细胞培养性能时发现的。ATF4系统可以成功在40 x 10^6 cells/mL的条件下运行60天，而ATF2系统在30x 10^6 cells/mL条件下无法维持细胞生长，导致细胞密度降低，实验提前结束 (图3A和3B)。细胞特异性产率也急剧下降，细胞特异性乳酸增加 (图3C和3D)。对2L/ATF2系统和滞留时间计算的检验表明，ATF2传输管路体积过大导致置换比例低，滞留时间延长 (ATF2为90-190秒，ATF4为70秒)。
图3. 低滞留时间ATF4（n=3）和ATF2系统（n=1）以及高滞留时间ATF2（n=4）中的（A）活细胞密度，（B）特异性表观生长率，（c）目的蛋白的特异性生产率以及（D）特异性乳酸生产。所有运行在40%溶氧条件下运行。
计算得出这些条件下的氧耗尽时间为38秒 (使用公式2)，明显低于ATF2的滞留时间，表明培养物长期暴露在ATF泵腔不受控制的环境中，可能会将细胞推入缺氧状态，最终导致培养崩溃。为了验证这一假设，在一个2L/ATF2系统中，将生物反应器中的溶氧从40%增加到70%。生长、活性、代谢和产率均稳定(分别见图4A、4B、4C和4D)，表明延长的滞留时间的负面影响可以通过提高系统中可用的溶氧量来抵消。
图4：ATF2系统的（A）活细胞密度，（B）特异性表观生长率，（C）目的蛋白的特异性生产率和（D）特异性乳酸生产，在运行中期调整溶氧DO（40-70%），可逆转向下的生长和代谢趋势。基线ATF2趋势（40% DO）用于比较结果。
(注意，这项关于溶氧增加的影响的研究实际上是作为运行末期研究进行的。在此之前，生物反应器已经生长至一个目标密度，然后在第45天进行细胞废弃，以达到大约40 x 10^6 cells/mL，以尝试一个新的实验。为了能够与上述ATF2经验进行比较，本研究的运行时间被更改了40天。)
为了使ATF2的滞留时间与ATF4的滞留时间一致，ATF2传输管路被重新设计为更窄的管路(内径6.4mm vs. 9.6 mm)。然后在标准的40%溶氧设定点条件下进行了成功的运行。图3中显示了其中一次成功的ATF2运行。细胞密度和细胞生长在50天内保持稳健，特异性乳酸产量也保持较低。特异性产率不会像之前的ATF2那样下降。(如图3C所示，10L/ATF4系统和改进后的ATF2系统之间的特异性生产力的差异仍然存在。我们假设这是由于其它需要解决的规模放大问题，而不是ATF滞留时间。)
为了进一步探索ATF滞留时间与成功运行之间的关系，我们进行了一项数据挖掘工作，并收集了不同细胞系、不同生物反应器和ATF规模的经验。利用死体积测量和置换率数据，我们用简化模型和Monte Carlo方法计算了ATF的理论滞留时间。在这两种情况下，我们观察到更长的滞留时间和运行失败之间有很强的相关性(表I)。
特定ATF的Monte Carlo模拟数据可以表示为滞留时间分布。作为一个例子，ATF4系统在置换率为3.5 L/min时的滞留时间分布如图5A所示。进入ATF系统的大部分细胞仅到达传输管路或过滤器，并在单个循环内返回生物反应器。然而，有一部分细胞到达泵腔，并被困在那里一个或多个循环。表I中的平均滞留时间是从这个CRBALO(至少到达泵腔一次的细胞)群体中计算出来的。
我们还可以比较不同ATF情况下的滞留时间分布。在图5B中，我们将典型ATF4操作产生的滞留时间分布叠加到长滞留时间ATF2的分布上。只考虑CRBALO滞留时间。我们可以看到，长时间滞留的情况受到低置换率 (导致细胞“逃离”泵腔的机会更少)和更大的死体积(导致每一个循环中泵腔内细胞离开的比例更小)的影响。
图5. （A）当置换速率为3.5 L/min，置换比例为0.32时，ATF4的滞留时间分布。直方图被划分为表示从未到达泵腔的细胞和至少一次到达泵腔的细胞(CRBALO)的不同区域。(B)两种情况下的CRBALO滞留时间分布：死体积大且置换率低的ATF2和死体积小且置换率中等的ATF4。
ATF中的流体动力影响
我们使用典型ATF管路规格 (补充材料中的表S-I)以及公式9和13来计算ATF2、ATF4、ATF6和ATF10的传输管路以及中空纤维过滤器内的最大EDR。图6A中绘制了这些设备在置换率操作范围内的EDR。在ATF2和ATF6中，最大的应激通常落在过滤器内。然而，对于ATF4来说，由于过滤器在单位体积流速下的纤维数量大约多两倍，中空纤维的EDR明显低于其它ATF。ATF10在传输管路中也看到了高EDR，因为这里我们假设使用双线配置，增加了壁面积。
图6：(A)不同ATF尺寸在各自置换率范围内的传输管路和中空纤维过滤器内的理论能量耗散率。实线表示传输管路中的平均EDR，虚线表示中空纤维过滤器中的最大EDR。累积EDR分布如图(B)所示，ATF2、ATF4、ATF6和ATF10分别在1、3.5、11和60 L/min的置换率条件下操作，以及(C) 3.5、5、6.5和8 L/min的置换率时的ATF4。对于EDR分布图，y值是一个颗粒花费超过或等于能量耗散率的平均时间(由x值表示)。尾巴长而大的分布可能对细胞健康、新陈代谢或生产力有害。由于假设混合均匀的紊流中所有颗粒的平均EDR相同，因此在传递管路EDR中分布出现直线下降。
值得注意的是，所有ATF和置换率条件中的所有EDR都远远低于文献中报道的致死EDR的典型值(10^6 W/m3及以上)。然而，其落在报告的亚致死反应范围内。在先前报道的一项实验中，CHO细胞在层流腔中持续暴露于仅925 W/m3的EDR(对应于0.8 Pa的剪切力)，被证实会导致生产力和自葡萄糖的乳酸产率的降低。但需要注意的是(1)这些细胞是贴壁型的，(2)它们持续暴露的应激条件与灌流系统不同，在后者中，细胞每隔几分钟才进入ATF几秒钟。另一项研究表明，低至400 W/m3的EDR可使生物反应器中悬浮培养的CHO的特异性生产率降低25%。其它实验显示，当EDR为60000 W/m3时，糖基化模式发生了变化 (但生长和代谢没有变化)。显然，流体动力应激可以显著影响细胞和产物，但阈值将根据细胞系、暴露频率和持续时间的不同而不同。
对于我们特定的实验系统，我们可以将EDR计算与Monte Carlo模拟相结合，得到理论EDR分布。累积分布函数(CDF)是可视化数据和帮助理解数据的一种有用方法。我们可以根据时间而不是概率进行CDF绘图，以快速显示细胞在不同EDR上的持续时间。在图6B中，我们绘制了四种ATF规模在典型置换率设定点上基于时间的CDF。我们看到，ATF6提供最少的EDR暴露，而ATF2和ATF10有更多的应激环境。同样，我们可以在图6C中观察到，随着置换率从3.5L/min增加到8 L/min，ATF4的EDR曲线也在增加。图6B和6 C中的两阶段模式是由于不同EDR贡献的结果，其源自中空纤维过滤器(较低EDR，可能的值的分布取决于颗粒的径向距离) 和传输管路（较高EDR，由于径向混合的假设，对于给定的配置为单个值)。
为了使这些类型的绘图有用，我们需要了解何时EDR具有生物学意义并能影响细胞培养或治疗性产品。我们在10L/ATF4系统中进行了实验，在灌流实验过程中，置换率逐步变化，并跟踪细胞的生长、大小、代谢和生产力。细胞培养在最低的置换率(2L/min)下无法进行，可能是因为在ATF中滞留时间过长(计算为140秒)导致缺氧(图7A)。当置换率超过5 L/min时，葡萄糖的乳酸产率、细胞特异性产率和活细胞直径均下降 (分别见图7B、7C和7D)。(特异性生长率没有明显变化，但这个测量中的噪音妨碍了我们得出确切结论的能力。) 回顾图6C，ATF4在5 L/min时经历的最大EDR约为15000 W/m3，表明这是一个EDR阈值，标志着该特定细胞系和系统的代谢和细胞形态发生了重大变化。
图7. 在10L/ATF4系统中，不同置换率设定点条件下的（A）特异性生长率，（B）乳酸产量，（C）细胞特异性产率以及（D）活细胞直径。
然而，我们应该注意到，这个实验不允许我们将EDR的增加与ATF环境中暴露频率的增加分离开来。当置换率从3.5L/min增加到8 L/min时，细胞在生物反应器中的平均滞留时间(例如，两次进入ATF之间的时间) 从2.9min减少到1.3 min。因此，在缺乏更多实验数据的情况下，我们在放大系统时，需要同时考虑EDR和暴露频率。
ATF过滤器污染
在两个重复的生物反应器中，通过5种不同的过滤器通量跟踪了ATF2和ATF4中的蛋白质筛分，通量从22到115 L/m2/d不等。所有这些实验都是在一个目标细胞密度下使用一个细胞系进行的。由于不同细胞系和细胞密度导致的过滤器污染率可能有很大差异，因此以下结果不能被认为是通用的，必须针对不同的情况生成新的实验数据。
针对每种条件，构建了筛分系数特性和相应的最佳拟合线 (使用产品活性和LDH活性测量)。(补充材料中针对ATF2的图S-5A和图S-5B以及针对ATF4的图S-5C和图S-5D分别为产品和LDH曲线。) 图8和表S-II(在补充材料中)总结了这些最佳拟合线的斜率，我们将其用于代表过滤器污染率。在这些计算中有大量的噪音，特别是对于需要在短时间内拟合的斜率。例如，75 L/m2/d的条件实际上显示了一些ATF筛分系数的增加，但这可能归因于该通量保持的时间很短 (7天)。尽管有这种潜在的噪音，一个普遍的(和预期的)趋势确实出现了：随着过滤器通量的增加，过滤器污染率增加。特别是，从图8中可以看出，在90 L/m2/d以上时，过滤器污染率非常显著(超过1%/d)。
图8. 通过ATF2和ATF4单元的产物活性和LDH活性测量，估计一系列过滤器通量条件下的过滤器污染率 。
为了从统计学上确认与过滤通量的相关性，并了解是否有任何其它因素明显有助于过滤器污染，我们使用JMP进行步进回归以检查ATF类型、生物反应器数量、过滤器通量和过滤器暴露。对两个连续因子(通量和暴露)的二次效应和交互效应也进行了研究。在所有这些因素中，通过对产品和LDH筛分进行的测量，发现只有通量可以被鉴定为与过滤器污染显著相关。这个统计分析的结果是一个简单的二元预测公式：
其中𝑟𝑓代表过滤器污染率(通过产品或LDH筛分系数测量)，𝑗是过滤器通量。(公式16中LDH和产物的系数见补充材料表S-III，预测趋势和置信区间见补充材料图S-6A和S-6B)。
当比较LDH和产物时，过滤器污染的程度有所偏移，但两种蛋白质污染率之间的置信区间有很大的重叠。趋势曲线的形状也非常一致，在65- 70 L/m2/d范围内，几乎看不到对过滤器污染的影响。在70 L/m2/d以上，随着过滤通量的增加，污染率显著增加。如果需要额外的信心，就需要使用DOE方法进行更多的实验来提高分辨率。
我们可以检查潜在的反应器/ATF/灌流速率组合，以估计何时过滤污染可能会引起问题，至少针对实验中的这种特定细胞系和目标细胞密度。表II列出了一些典型情况下的过滤器通量。如果我们决定继续将滤液通量维持在60 L/m2/d以下，我们就不能仅使用一个ATF (80 L/m2/d)运行一个100L的生物反应器，而是需要两个同时运行的单元(40 L/m2/d)。类似的方法在500L规模上也是必要的 (两个ATF10而不是一个)。当考虑到2000L的一次性生物反应器时，ATF数量的限制也会出现。即使是一对ATF10，其过滤通量也会比推荐的最大通量70 L/m2/d大3倍。
其它研究显示了多种可能的过滤器性能，过滤器污染率从低于0.5%/d到约3%/d 不等。正如前面提到的，需要记住的是，本研究中报告的数据都是使用一种过滤器类型在一个目标细胞密度下使用一种细胞系生成的。不同的细胞系、细胞密度、过滤器类型和操作设定点(例如，置换率) 可能导致不同的污染趋势。同时，产品的稳定性 (或缺乏稳定性) 也会影响可接受的筛分系数范围。相对稳定的产品将能够更好地耐受低筛分系数(即在通过过滤器到达下游收获之前，在生物反应器中停留的时间更长)。
总结
在本文中讨论的ATF考虑因素涉及许多不同的操作参数，形成了一个复杂的、具有各种约束的高维设计空间。例如，过滤器污染是置换率、灌流速率、过滤器面积、细胞密度等综合导致的。ATF滞留时间(及其可接受性)也与置换率有关，但除此之外，还取决于细胞密度、溶氧水平和ATF死体积。流体动力应激取决于置换率以及传输管路和过滤器的尺寸，而其严重程度与细胞系有关。图S-7(补充材料)定性地总结了部分结果，指出必须通过这些约束来找到可接受的操作设定值和范围。
图S-7：围绕ATF操作的一些约束条件的定性示意图。
我们可以综合前几节的结果和结论，形成ATF规模放大或缩小的一般方法：
1. 找到生物反应器工作体积和ATF的合适组合，以达到过滤器通量的近似匹配。在过滤器污染部分描述的情况下，上限约为60L/m2/d，但在其它情况下，上限将是可变的，其取决于以下几点考虑：
a.生产生物反应器的预期持续时间
b.生产生物反应器的目标细胞密度
c.细胞系和产物导致过滤器污染的倾向性
d.产物的稳定性
2. 选择一个符合以下标准的ATF置换率 (通常，供应商建议的设定点会与此标准相当接近)：
a. ATF滞留时间应低于75秒 (当细胞密度较高时，可能需要更短)
b. ATF剪切应力应低于某些诱导变化的阈值。对于流体动力应激部分中研究的细胞系，这个阈值为15000W/m3，但这可能取决于所研究的细胞系的剪切敏感性
c.生物反应器滞留时间应大于或等于当前规模下的滞留时间
如果很难满足这些不同的约束条件，必要时可以使用其它手段：
虽然ATF过滤对细胞培养过程有许多潜在的影响，但本文提出的研究已经证明了如何通过建模和实验来量化其中的一些影响，从而实现更稳健、更易于理解的实施和操作。随着生物反应器工艺的强化以及细胞密度、产量和体积的提升，对过滤系统的需求也会相应提高，ATF建模和理解将变得更加有价值。
原文：J.Walther, J.McLarty, T.Johnson, The effects of alternating tangential flow (ATF) residence time, hydrodynamic stress and filtration flux on high-density perfusion cell culture. Biotechnology & Bioengineering, 2018, 116,2:320-332.