以经济高效的策略，克服基因治疗病毒载体生产的挑战

基因治疗通过将改变特定细胞功能的遗传物质导入患者体内来治疗疾病，包括遗传性疾病和肿瘤等，其关键步骤是通过递送载体有效地将基因递送至目标组织/细胞。尽管脂质纳米颗粒等非病毒载体递送策略近来获得了行业极大的关注，但病毒载体仍是目前基因治疗产品管线的主流。现代化的病毒载体基因治疗可分别两种治疗策略，包括体内基因治疗，其直接将携带治疗性转基因的病毒载体给药给患者；或者体外递送治疗性转基因，即提取患者自体或异体来源细胞，然后通过引入治疗性转基因对细胞进行基因修饰，培养扩增后，再将其回输至患者体内。常见的四种基本基因治疗方式包括：基因替代，递送功能性基因以替代功能异常基因；基因沉默，使对细胞有毒性的突变基因失活；基因添加，外源基因过表达以调整细胞功能；以及基因编辑，对患者基因组中的基因进行永久性操作。

通常，病毒载体由以下三个组成部分定义：1. 包裹基因载荷的蛋白质衣壳和/或囊膜，其定义了载体的组织或细胞趋向性以及抗原识别；2. 目的转基因，当其在细胞中表达时，可产生所需的治疗效果；3. “调节盒”，组合的增强子/启动子/辅助元件，控制转基因作为附加体或染色体整合体的稳定或瞬时体细胞表达[1]。载体的各个设计方面对于每种病毒载体平台都是不同的，有其独特的考虑。此外，当将病毒载体开发用于临床试验和商业化药物时，还需要考虑开发适合工业化规模且符合良好生产规范（GMP）的工艺，以实现目标产品快速、经济且高效的生产，提高其患者可及性。

本文将介绍已被广泛用于有效的基因治疗开发且已有相关产品获得监管机构批准的三种主要病毒载体：腺病毒（AV）、腺相关病毒（AAV） 和慢病毒（LV），并重点介绍其生产工艺开发的挑战和潜在解决方案。

腺病毒载体

腺病毒（AV）是无囊膜病毒，拥有一个直径约90-100 nm的二十面体蛋白衣壳，容纳26- 45 kb的线性双链DNA基因组。AV是体内基因递送最有效的途径之一，因为大多数人体细胞都表达一级AV受体以及二级整合素受体。因此，人体细胞很容易被AV载体感染，从而产生高水平的转基因表达，且缺失了全部腺病毒基因、仅保留反向末端重复区（ITR）和包装信号序列的新一代无病毒载体的开发，能够规避抗腺病毒载体免疫[2]。另外，AV的一些遗传缺陷，如对AV衣壳的免疫诱发和AV基因的低表达，现在可能被证明有利于抗肿瘤免疫疗法的开发，即诱导对肿瘤的免疫或直接杀死肿瘤细胞。AV已被开发用作基因治疗的病毒载体以及作为溶瘤病毒，它也是最常用于预防感染性疾病的疫苗的病毒载体。

腺病毒载体的一般工艺流程如下图所示。在上游病毒生产中，可选择的宿主细胞系包括HeLa、A549、PER.C6和HEK293，其中，在工业规模条件下，以HEK293应用最多。细胞培养可采取贴壁或悬浮策略。前者工艺相对容易构建，但往往涉及较多的手动操作，且只允许通过规模扩展来提高产量，如细胞工厂，所以，尽管细胞的悬浮驯化可能较为耗时，且会降低细胞特异性产率，但从工艺规模放大的可行性角度考虑，一般倾向于选择后者，且悬浮培养往往意味着转向无血清培养基，这是生物制药生产中的另一个额外优势。

生产细胞先在细胞培养瓶中扩增，后转移至摇摆式或搅拌罐式生产生物反应器继续生长至目标密度，再以经认证和检测的病毒种子储液感染，工艺结束时收获新生产的腺病毒。对此，首先需针对培养基支持细胞生长的能力选择和优化培养基，而在感染和病毒生产阶段，多种培养基成分的特异性消耗速率将增加，所以确定最佳培养基配方时，还需将其纳入考量。此外，为确保最佳生产工艺，需定义最佳工艺相关参数，如感染复数、感染时的细胞密度、感染时间以及收获时间。

腺病毒载体（AdV） 解决方案（双击查看原图）

在收获步骤中，可通过添加去垢剂，如Triton X-10或Tween 20，裂解细胞，以从宿主细胞释放腺病毒。细胞裂解的另一种方法是机械均质，在这种方法中，培养基中的细胞被施加高压而强迫通过一个孔，当细胞进入时受到压缩而排出时膨胀，由于高剪切力，膜被破坏，研究已经证实这是种具有良好可放大性的方法。细胞裂解步骤可结合使用核酸酶处理，以消解宿主细胞DNA。收获液的澄清可使用直流过滤方式进行，以去除细胞、细胞碎片等粒径较大的杂质颗粒。澄清后的病毒料液可使用MWCO 500或750kD的切向流过滤组件进行浓缩和换液。之后，可选择使用阴离子交换层析作为中间体捕获纯化步骤，并以体积排阻层析等正交策略进行精纯。在最终除菌过滤之前，以切向流过滤进行二级浓缩。

腺相关病毒载体

腺相关病毒（AAV）是基因治疗中最常用的载体，其是非致病性细小病毒，直径约20nm，无囊膜，基因组长约4.8kb，其两端为反向重复序列（ITR），对复制、衣壳化等过程有重要作用，中间为rep与cap两个开放阅读框。AAV本身不编码DNA聚合酶，仅依赖宿主细胞或辅助病毒合成自己的基因组，所以无法自主完成复制。AAV在人类和其它灵长类中相当普遍，目前已知有11个血清型，此外，为提高AAV在临床和研究作为载体的效率，开发了许多AAV的人工变型，其在核酸序列，特别是衣壳蛋白的高可变区存在差异，从而导致在基因递送中的不同特性[2]，如全球第1个获批的、基于AAV的产品Glybera®利用AAV1递送脂蛋白脂肪酶（LPL），以治疗LPL缺乏患者。2017年获批的Luxturna®基于AAV2，用于治疗莱伯氏先天性黑蒙，后者导致进行性失明，而2019年获批的Zolgensma®基于AAV9，用于治疗脊髓型肌萎缩（SMA）。

AAV的上游生产有不同的平台策略可选，包括单纯疱疹病毒（HSV）感染、昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统以及稳定生产细胞系，但基于HEK293细胞质粒瞬时转染的方法是目前制备临床试验物料的主流方法，其具有更高的适应性且易于使用，前期工程工作量较低，有助于快速启动首次人体研究[3]。基于瞬时转染生产AAV的典型工艺步骤包括：基于贴壁或悬浮培养的细胞扩增、质粒转染、病毒载体生产、细胞裂解、纯化–包括澄清、亲和捕获层析、离子交换精纯层析、切向流过滤浓缩/洗滤和最终过滤以及制剂/灌装。

与AV上游策略类似，贴壁 vs. 悬浮培养的选择需根据平台技术能力、所处的开发阶段、目标适应症和给药策略以及预计病毒载体需求量等因素综合考虑，对于患者群体基数较大、需系统性给药或每剂病毒载体含量较高的应用，开发基于悬浮培养的生产策略将更有利于确保所需的规模缩放能力，已有报导实现了高达2,000L的AAV悬浮培养生产[4]。上游工艺开发的目的是探索病毒生产的最佳条件，包括通过调整转染条件而提高转染效率并确保其在大规模生产条件下的一致性，以及通过优化培养基配方等策略增强病毒生产力、维持病毒感染性。

图为：HEK293表达系统工艺路线（双击查看原图）

图为：SF9昆虫表达系统工艺路线（双击查看原图）

 腺相关病毒载体（AAV）解决方案

尽管有些AAV血清型会在培养过程中部分分泌病毒颗粒至细胞培养液中，但为了提高病毒的收率，AAV的下游工艺以在封闭条件下进行的细胞机械（可点击此处了解详情）或化学裂解以及DNA片段化开始，之后的澄清步骤旨在去除残留的大量质粒DNA以及细胞裂解产生的宿主细胞污染物。澄清过滤器的选择需考虑浊度降低水平、高产物收率以及规模放大的简便性。对于AAV的亲和层析捕获，目前已有针对多种血清型的特异性亲和填料，通常，单步亲和捕获即可达到较高的纯度，但为确保达到特定的杂质去除水平要求，一般结合使用离子交换层析作为精纯步骤。特别是对于AAV生产中分离空衣壳和完整衣壳的挑战，离子交换层析是目前生产规模中最常用的方法。空衣壳被监管机构认为是过程中杂质，需尽可能降低其百分比，并控制空/完整衣壳比例，以确保基因治疗产品的一致性。切向流过滤旨在浓缩产物并置换至合适的缓冲液体系，鉴于AAV较小的粒径，可选择MWCO 100kD的膜组件，而除菌过滤旨在降低微生物负荷，满足所需的无菌性法规要求。

慢病毒载体

慢病毒是逆转录病毒的一种，粒径为80-120nm，由单链RNA序列组成，其转录成DNA并可整合到宿主基因组中，导致持续感染。大多数慢病毒载体源于HIV-1，并保留整合至感染细胞基因组的能力。LV由于能够更有效地转导非增殖或缓慢增殖的细胞，在临床应用中非常流行。近来，多个使用临床试验使用第三代自灭活LV将基因导入造血干细胞，以治疗原发性免疫缺陷或血红蛋白病[2]。LV最常见的应用是通过嵌合抗原受体（CAR）或克隆的T细胞受体递送引入基因，以产生对抗肿瘤的免疫。应用LV开发的CAR-T细胞疗法已经在血液恶性肿瘤中获得成功，并有多个产品获得各地监管机构批准，Novartis的Kymriah®和BMS的Breyanzi®[5]。

对于慢病毒的上游生产，尽管已经有研究证明制备稳定的慢病毒载体包装/生产细胞系是可行的，其有潜力提高批次间的一致性，保证供应并降低成本[6]，因其可简化LV生产的操作和供应链，但往往需要较长的细胞系开发构建时间，所以基于HEK293T细胞以质粒DNA瞬时转染的策略仍是慢病毒载体大规模生产的主要选择。对于细胞培养，在开发阶段，鉴于仅需要较小的批次体积，以及HEK293T细胞的贴壁特性和耗材的简单可获得性，以贴壁培养为主导。但随着规模放大，需要更高且更一致的批次规模，生产需转移至在摇摆式生物反应器或搅拌罐生物反应器中进行的悬浮培养，而培养基和添加物的选择直接与生产细胞的扩增和活性以及下游工艺的成功有关，因培养基可影响载体的稳定性并组成进入下游的进样料液，需仔细优化。

慢病毒载体（LV）解决方案（双击查看原图）

相比AV或AAV，LV下游工艺的更大挑战在于其为囊膜病毒，固有的复杂性和敏感性需要快速的工艺处理，比如其对冻融循环、盐、pH、剪切以及缓冲液渗透压更为敏感，且颗粒热稳定性较低，37℃下半衰期为7-8 hr[7]。LV的下游工艺也可分为3个主要阶段，包括收获和澄清；中间体纯化，其中包括1个或多个浓缩和纯化步骤；精纯、制剂以及选择性进行的除菌过滤。

LV是细胞外产物，由生产细胞释放到培养液中，所以，收获液质量高度取决于细胞活性，其决定了宿主细胞源性杂质的含量。澄清旨在去除细胞和细胞碎片，深层过滤是该步骤一个简单且经济的选择，经优化后，可达到接近100%的收率。为提高最终产品的整体生物安全性，并符合法规标准，通常需要核酸酶处理，以消解核酸，这也有利于降低料液粘度，方便后续步骤操作，其通常在澄清步骤后进行，但也有报导在更为后续的阶段体积进一步降低后进行。

层析是纯化方案的关键技术，旨在去除蛋白质、核酸、低分子量杂质以及脂质等，以结合-洗脱模式操作的阴离子交换层析和以流穿模式操作的复合模式层析已被报道单独或结合用于LV的纯化，但如前所述，由于LV对盐和pH等条件敏感，需仔细优化层析缓冲液条件。此外也有报道使用固定金属亲和层析和体积排阻层析，但通常限于较小的规模。TFF是快速且稳健的料液浓缩和换液技术，对于LV，可选择MWCO 750kD的中空纤维过滤器。药物底物灌装前的除菌过滤可使用0.22μm过滤器，但考虑LV较大的粒径，报道该步骤损失可达到30-50%，一种降低损失的策略是在最终TFF步骤之前进行除菌过滤，或者使用封闭系统实现无菌工艺而跳过该步骤。

总 结

生物制药行业越来越重视开发复杂的基因疗法，以预防、治疗或潜在地治愈一系列危及和改变生命的疾病，而随着越来越多基于病毒载体的基因治疗从早期概念验证、工艺开发行进到临床试验并接近或已经获批，这种策略已经成为基因治疗领域的基石。而出于产品完整性和安全性等的考虑，开发商也在积极寻找方法来优化工艺，以实现稳健的GMP生产和规模放大，对此，从流体处理到生物反应器和纯化系统的高效、一次性使用方案即是该道路上的赋能技术，且鉴于COVID-19对全球生物工艺供应链的干扰以及激烈的市场竞争格局，确保稳定、安全的原材料供应来源是保障基因治疗产品开发，加速产品临床试验和商业化的先决条件。多宁生物致力于打造国内领先的生物工艺平台，将以专业、创新、可持续的本地化解决方案，持续助力中国基因治疗行业的发展。 

参考文献：

1. J.T.Bulcha,Y.Wang,H.Ma,etal.,Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduction and Targeted Therapy,2021,6:53.

2. S.Ghosh,A.M.Brown,C.Jenkins,etal.,Viral Vector Systems for Gene Therapy:A Comprehensive Literature Review of Progress and Biosafety Challenges.Journal of ABSA International,2020,25(1):7-18.

3. T.Dobrowsky,D.Gianni,J.Pieracci,etal.,AAV manufacturing for clinical use: Insights on current challenges from the upstream process perspective. Current Opinion in Biomedical Engineering,2021,20:100353.

4. J.Markarian,"Finding Success in AAV Manufacturing," BioPharm International 34(3)2021.

5. A.Davidson,G.S.Toledo,K.Lilova,Considerations for the development of autologous CAR-T cell products.Cell & Gene Therapy Insights 2021;7(11),1685–1696.

6. P.Archibald,A.Shillings,Enabling development of commercial-ready lentiviral vector manufacturing processes using stable producer cell lines.Cell & Gene Therapy Insights, 2021.

7. C.Perry,A.Rayat, Lentiviral Vector Bioprocessing.Viruses,2021,13,268.

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