全新构象机制启迪下的靶向炎性小体药物设计
炎性小体与自免疾病药物的开发
炎性小体（Inflammasome）是机体应对非感染炎症（Sterile inflammtion）的重要免疫机制，炎性小体广泛参与自身免疫性疾病的机制被揭示以来，设计靶向炎性小体及相关通路的小分子抑制剂被寄以厚望。
炎性小体是多体复合物，其中NLRP3蛋白受到严格的平衡调控，在响应危险信号时发挥重要作用。10年来靶向NLRP3蛋白的药物发现工作一直进行中，也有多个化合物进入临床阶段，但未看到理想的产出。此前多年，MCC950作为唯一发现的具有较强抑制作用的小分子配体，发挥阻断NLPR3炎性小体激活、降低炎性因子释放的功能；在50多种动物炎性模型中表现出积极的效果，被推入临床试验阶段【1】。但由于存在严重的脱靶效应和导致的毒性，MCC950的临床试验在II期后即告终止，参照MCC950骨架衍生获得的小分子药物也先后陷入相似的窘境。此后多年，该领域陷入沉寂。日前， Novo Nordisk（诺和诺德）与Ventus Therapeutics就后者先导项目——靶向NLRP3的外周限制性小分子抑制剂的在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、慢性肾脏与其他心脏代谢疾病领域的开发与商业化权力达成授权协议。此项交易中Ventus Therapeutics将获得来自Novo Nordisk的7000万美金的首付款，未来以临床、监管与商业里程碑进展获得高达6.33亿美金的收益【2】。
破冰——阐明结构与机制
NLRP3炎性小体抑制剂开发纷纷陷入困境的原因，一方面在于此前一直缺乏对NLRP3蛋白三维结构的报道；另一方面，此前临床失败分子进行脱靶活性筛选中，始终未发现明显作用靶点。这使得业界对NLRP3炎性小体作用机制产生新的设想。直到2021年Novartis报道了利用冷冻电镜结构解析和三维重构技术对NLRP3蛋白及与底物形成的共晶结构进行的研究，揭示了一些重要发现，且这些发现均指向全新的构象变化机制：
● 虽然NLRP3激活状态以ATP水解为先决条件，但解析实验中只观察到ADP结合在NLRP3蛋白NACHT结构域并形成的共晶体，未观察到ATP参与的共晶形成；
● NACHT结构域与小分子配体的共晶结构解析结果表明，NACHT处于常闭的构象，且ATP水解先于结合域内构象改变；
● 比对NLRP3的计算模型和电镜结构，突变多聚集在激活-非激活状态转换的交界面；疾病相关的NLRP3突变很可能与亚结构域界面稳定性削弱相关，而非直接影响酶活或核酸交换。
从结构的角度分析全长NLRP3蛋白，由PYD、NACHT、LRR三个结构域组成，其中NACHT为核心调控结构域。NLRP3在生物体内具备活性和非活性两种状态：在非活性构象时，NACHT的NBD、HD1、WHD以及HD2四个子结构域密切接触，呈聚集状态；激活过程中，NBD和HD2相对距离拉长，四个结构域变得更为分散。理论上，维持四个子结构域的聚集状态即可稳定NACHT非活性态，进一步达到抑制NLRP3的效果。
图1 （A）NLRP3序列组成。（B）NACHT结构由非活性态转变为活性态。
近日，来自德国波恩大学的研究小组，通过冷冻电镜技术揭示了小分子化合物MCC950与NLRP3蛋白的复合物结构；加之Novartis基于X-Ray对NP3-146（MCC950衍生物）与NACHT共晶结构的确认，揭示了该两分子结合在NACHT非活性状态下的四个结构域的交界位点，通过维持NBD、HD1、WHD、HD2结构域的非活性构象进而实现NLRP3抑制效果。也进一步验证了通过化学小分子稳定NACHT非活性构象的可行性，同时共晶所揭示的结合模式为后续进一步的药物设计与评估提供了计算参考。这也为开展有效的药物设计提供了全新思路：阻断活化所必须的NACHT构象改变，比竞争ATP结合位点、阻断水解是更合适的策略。
晶泰科技在NLRP3构象机制研究中的发现与研发策略
在进行分子设计及评估之前，需要对靶点的潜在活性位点进行计算评估，包括结合口袋环境、重要相互作用、高能贡献氨基酸，药效团等。
图2 对NLRP3蛋白进行药效团分析
(A)小分子结合口袋情况；(B)NP3-146与蛋白的重要相互作用；（C）对NP3-146结合起重要贡献的氨基酸；（D）药效团模型。
结合口袋分析
充分了解结合口袋环境，在理性药物设计过程中非常有必要。如图A所示，可药口袋可以分为三个区域，分别是口袋内部的疏水区、口袋中部的正电性区域、以及口袋外部的溶剂暴露区。三个区域可以反映出结合在该位点分子的结构特征，即疏水基团和亲水基团由电负性较高的linker连接形成的小分子化合物。
关键相互作用分析
反观NP3-146分子与NACHT共晶结构（图2B），可以发现分子中的磺酰脲结构锚定在口袋中部正电性通道中，脲基和HD2的ARG-578，NBD中的ALA-228形成多个氢键作用，实现了HD2- NBD的连接效果。此外，磺酰基和ARG-351发生氢键作用，叔丁醇和GLU-629发生氢键作用进一步将HD2、NBD紧密联系。此外，磺酰脲结构中间的N-H会受到邻位的吸电子基团碳基以及磺酰基影响去质子而带负电荷，恰好可以和位于NBD结构域上的ARG-351发生盐桥作用，加强了分子与NBD结构域的亲和力。上述相互作用力稳定了HD2、NBD子结构域相对位置，可做为分子设计过程中的重要考量因素。
关键残基分析
为了探索与活性分子重点结合的残基，通过FEP能量分解方法计算了口袋周围的各个氨基酸对NP3-146结合贡献，我们识别了关键性的高能贡献氨基酸残基，所设计的分子必须维持与这些热点氨基酸的稳定结合，作用至关重要。
药效团分析
此外，为了便于后续对大规模分子生成的结果进行初筛，除了分子对接手段外，利用晶泰科技特色AI技术构建了药效团模型。如图2D所示，该模型由两个氢键受体，一个氢键供体以及一个疏水中心构成。经测试，该模型具备区分活性分子以及非活性分子的能力，可用于大规模分子筛选。
在对NACHT活性口袋充分探究的基础上，晶泰科技利用技术专长构建了一整套有效的分子评估及迭代体系，已成功发现高亲和力的活性化合物：
● 1. 通过AI分子生成或者理性设计获取待评估分子库；
● 2. 通过成药性过滤，再则预测分子的结合模式，并以是否能够发生关键性氢键、是否匹配重要药效团以及是否具备较低的应变能等条件筛选Pose；
● 3. 使用专利性XFEP工具计算小分子和靶蛋白的结合亲和力并给出推荐化合物。
图3、分子评估流程图
参考文献
【1】Coll RC, A small molecule inhibitor of NLRP3 inflammasome for the treatment of inflammatory disease. (2015) Nature Med. 21 248-255
【2】Ventus Therapeutics Enters Exclusive Development and License Agreement with Novo Nordisk for NLRP3 Inhibitor Program.
【3】Dekker C, Crystal structure of NLRP3 NACHT domain with an inhibitor defines mechanisms of inflammasome inhibition (2021) Journal of Molecular Biology 433, 167309
【4】Hochheiser IV, Structure of the NLRP3 decamer bound to the cytokine release inhibitor CRID3. (2022) Nature 604, 184–189.
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