文章题目
雌激素相关受体γ激动剂DY131改善脂多糖诱导的急性肝损伤
Estrogen-Related Receptor γ Agonist DY131 Ameliorates Lipopolysaccharide-Induced Acute Liver Injury
文章信息
合作单位：东南大学
发表期刊：Frontiers in Pharmacology
发表时间：2021.4.23
败血症相关的肝功能障碍在临床实践中仍然是一个挑战，死亡率高和特殊治疗有限。DY131是孤儿受体雌激素相关受体(ERR)γ的药物兴奋剂，在调节能量生成、氧化代谢、细胞凋亡、炎症反应等方面起着至关重要的作用。然而，它在急性肝损伤中的作用尚不得而知。本研究通过RNA-seq测序等方法评估了DY131对脂多糖(LPS)诱导的肝损伤的影响。
LPS (L2630， LPS 来自E. coli 0111:B4)和DY131 (GSK9089) ，DY131溶解在二甲基硫化物(DMSO)中，并进一步用盐水稀释。8~9周的成年雄性C57BL/6J小鼠。
小鼠随机分为三组：对照组、LPS组和DY131 + LPS组。1) 对照组 (n = 10)：小鼠获得同等量的盐水：2) LPS 组 (n = 10)：小鼠腹腔注射LPS，剂量为10mg/kg;3) DY131 + LPS 组 (n = 10)：小鼠于LPS(10mg/kg)注射前，连续3d，腹腔注射DY131(5 mg/kg/d，即在 200 μl盐水中稀释)。24h后麻醉处死。 小鼠用盐水(载体)或DY131处理3天，以评估体内DY131的毒性(每组n = 5)。
1. ERRγ在 LPS 处理小鼠的肝脏中受到抑制
通过 qRT-PCR 和胶图显示(图 1A–C)，在mRNA 和蛋白质水平上，LPS 处理后的小鼠肝脏中的ERRγ显著减少。免疫化学(图1D)进一步证实了这种下调表达。表明，肝脏ERRγ的减少可能与败血症肝损伤有关。 图1. LPS处理后，小鼠肝脏中ERRγ表达情况
2. DY131预处理减弱LPS诱导的小鼠肝损伤
为了确定 DY131 对 LPS 引起的败血性肝损伤的影响，小鼠在 LPS 给药前使用 DY131 进行预处理。结果显示，LPS处理的小鼠血清中ALT、AST和LDH水平显著升高。DY131预处理显著降低了这些肝酶的含量(图2A–C)。如H&E染色结果所示，对照小鼠肝脏中显示具有中央静脉和周围肝细胞的正常肝结构，而LPS处理小鼠的肝脏显示中央静脉、血窦体充血，以及入口区域炎症细胞的渗透增加。然而，所有这些形态变化都在DY131治疗的小鼠肝脏中减弱(图2D)。此外，PAS染色用于检查小鼠的肝糖原。对照小鼠在肝脏中表现出强烈的PAS染色，这表明肝脏中富含糖原(图2D)。然而，在LPS处理小鼠中，肝糖原水平显著降低。DY131处理可以部分恢复肝脏中的糖原，表明DY131对肝葡萄糖的生成或储存有潜在保护作用。估计使用了修改后的组织活动指数(HAI)的肝组织病理学评分(基于H&E染色)，显示与LPS组(图2E)相比，DY131预治疗的小鼠的损伤评分较低。LPS 给药后48h的存活率估计。如图2F所示，10只小鼠中，有9只在LPS处理后48h内死亡，而在DY131治疗组中10只小鼠中只有3只死亡。这一结果表明，DY131治疗提高了LPS治疗小鼠的存活率。综合结果表明，使用DY131进行预处理可以改善小鼠因LPS引起的肝损伤。图2. DY131预处理减轻LPS引起的肝损伤
3. DY131预处理减轻LPS处理的小鼠氧化应激 在氧化代谢调控中，ERRγ的缺失会导致代谢缺陷和氧化应激。本文研究了DY131对LPS处理的小鼠肝脏氧化应激的潜在影响。LPS处理消耗肝细胞的GSH并增强氧化应激标记物MDA，而DY131预处理可部分恢复GSH水平并降低MDA水平(图3A，B)。同时，LPS处理使SOD1和SOD3在mRNA水平显著降低，被DY131部分逆转(图3C)。Western印迹进一步显示，DY131预处理在一定程度上恢复了LPS诱导的SODs还原(图3D，E)。DHE染色检测各组肝细胞ROS水平。如图3F，G所示，DY131减弱了LPS诱导的肝脏ROS的增强生产。这些结果表明ERRγ激动剂DY131可通过抑制LPS诱导的氧化应激而改善肝功能。图3. DY131改善了LPS处理小鼠的氧化应激
4. DY131 预处理改善了 LPS 治疗小鼠的炎症反应 LPS引起的肝细胞损伤的发生与肝脏和血液循环炎症的增强密切相关。本研究中，LPS组TNF-α和IL-6的血清水平显著增加，而DY131的预处理有效抑制了这些细胞因子的水平(图4A，B)。LPS处理的小鼠的肝脏中，TNF-α、IL-6和IL-1+的mRNA表达均显著增加，而DY131预处理(图4C-E)显著降低了mRNA表达。对炎症小体的关键成分NLRP3的表达进行检测。如图4F所示，LPS在肝脏组织中诱导的NLRP3的表达通过DY131治疗减少。此外，如免疫化学所证明的，IL-6和IL-1+的肝表达在对照小鼠的肝脏中可以忽略不计，而在LPS治疗的小鼠的中央静脉和入口区域周围可以看到两种细胞因子的强烈表达。然而，在DY131处理的小鼠中，肝脏中观察到IL-6和IL-1+的阳性染色减少(图 4G)。以上数据表明DY131对LPS引起的肝脏和血液循环炎症有很强的抑制作用。
5. DY131 防止 LPS 处理后小鼠肝细胞凋亡 肝细胞凋亡发生在包括LPS在内的多种刺激的可逆和不可逆早期。本研究中，通过DY131预处理，在LPS处理小鼠肝脏中本高表达的Bax mRNA表达显著减少(图5A) 。DY131抑制了LPS诱导的半胱氨酸蛋白酶-3和Bax裂解蛋白水平的增强(图5B-D)。此外，经DY131预处理后，LPS处理的小鼠中TUNEL阳性肝细胞数量的增加明显降低(图5E，F)。这些数据表明ERRγ激动剂DY131对LPS诱导的小鼠肝细胞凋亡具有保护作用。
在小鼠体内注射了相对较低的DY131(5mg/kg)剂量，为确定潜在的药物不良反应，分别从载体(生理盐水)组和DY131治疗组分析了肝肾功能。数据显示，DY131对肝功能和肾功能(图6A，B)没有明显的副作用。此外，肝组织的H&E和PAS染色在形态和糖原水平上分别没有差别(图6C)。这些数据表明，目前DY131的剂量对小鼠没有明显的毒性。 图6. 以5mg/kg的剂量评估DY131的体内毒性
7. DY131 预处理逆转了 LPS 处理后小鼠肝脏中改变的炎症和代谢通路 在对照组和LPS组之间总共发现4918个DEG，在LPS和DY131+LPS组之间发现了143个DEG [Fold Change>2，p value< 0.05 ]。Venn图显示，所有三组的119个DEG 均发生显著变化(图 7A)。为进一步检查119个DEG的表达变化模式，使用了基因表达动力学的STC算法，将119个基因放置在16个表达模式图谱(图7B)中。共有五种表达模式，其中图谱 3、5、7、8 和 13 具有统计学意义(图 7B)。图谱 5 中的基因在 LPS 组中逐渐向上调节，然后在 DY131 处理组中向下调节，而图谱8 由 LPS 组中抑制的基因组成，并在 DY131 处理组中逆转。这两个图谱中包含的基因分别显示在分层聚类热图中，该图显示了 LPS 和 DY131 + LPS 组(图 8A，B)之间的一般变化。这些数据表明，DY131可以在转录水平上逆转LPS引起的基因表达。此外，KEGG分析根据图谱5和图谱8的基因揭示了各种富集相关的途径 (图8C，D)。图谱 5 和图谱8 中显著丰富的通路分别是 TNF 信号通路和代谢通路，这表明炎症症状受到抑制，而新陈代谢则通过 DY131 治疗后(图8C–F)得到改善。此外，通过进一步分析了RNA-seq，确定一些炎症、凋亡和代谢基因的表达，并观察了一致趋势(图9A–C)。所有这些数据都提供了全面的证据，表明DY131可以缓解炎症和凋亡，并改善受LPS影响的小鼠肝脏的代谢状况。图7. venn图
图8. DEGs聚类图、KEGG通路分析和层次聚类图图9. 与炎症、凋亡和新陈代谢有关的基因的表达模式。(A) 与炎症反应有关的基因。(B) 参与凋亡反应的基因。(C) 与代谢过程相关的基因。*p < 0.05，** p < 0.01， ***p < 0.001 和*** p < 0.0001
ERRγ在LPS处理的小鼠的肝脏组织中表达下调。用DY131预治疗可改善LPS诱导的肝损伤，如减少肝酶的释放(ALT、AST和LDH)，改善肝组织形态学损伤，减轻氧化应激、炎症和细胞凋亡。同时，DY131对小鼠肝、肾功能无明显副作用。最后，转录组学分析显示，DY131能显著逆转LPS处理的小鼠炎症和代谢异常通路，为DY131对LPS诱导的肝损伤的保护作用提供了更多的证据。总之，这些发现强调了DY131可能通过抑制氧化应激、炎症和凋亡对LPS诱导的肝损伤的保护作用。
Haoyang, Jiaye Liu, Yang Du, Shengnan Zhang, Weidong Cao, Zhanjun Jia, Wei Gong, Aihua Zhang. Estrogen-Related Receptor γ Agonist DY131 Ameliorates Lipopolysaccharide-Induced Acute Liver Injury[J]. Frontiers in Pharmacology, 2021.
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