【原创】蛋白变构位点的设计与筛选

    识别靶标蛋白变构位点是筛选和优化变构调节剂的基本先决条件。原则上，和蛋白底物活性位点空间上不同的任何功能性位点都可以被认为是变构位点。从进化角度讲，蛋白上变构位点比高度保守的底物位点具有大自由度，从而造成通过保守序列或结构单元来识别蛋白上的变构位点是非常困难的。当然这种高度变异性也造成了变构调节剂具有较好天然选择性（见“药物设计与变构之激酶篇”）。当前，绝大多数已知的变构位点都是在检测蛋白和配体之间的结合亲和力或动力学改变的各种实验中偶然发现的。随着近年来对变构位点特征的了解和光谱技术的发展，一些合理设计识别变构位点的实验方法陆续开发，今天和大家一起来总结一下这些方法和其识别的代表性变构位点。

1二氧化硫捕获法（Disulfide Trapping）

二氧化硫捕获是由Well等人开发的一种用于检测给定蛋白上的变构位点的直接方法[1]。这种方法对蛋白上潜在感兴趣位点中的天然或者突变引入的半胱氨酸残基进行含有二硫键的化合物库进行筛选，获得阳性化合物后通过质谱及X射线晶体等检测其是否与该位点半胱氨酸残基之间形成二硫键。如果存在通过二硫键结合且影响蛋白功能的化合物存在，则这个位点也被同时识别为变构位点。该方法代表性成功案例是在常见的致癌突变体K-Ras（G12C）上识别其变构位点并在此位点上筛选出6H05（43，图  13）和2E07（44），进而优化设计出化合物6（45）[2]。

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荧光标记法（Fluorescent Labeling）

这种方法是通过将荧光基团通过化学反应共价连接到蛋白上的潜在感兴趣位点上的特定残基上进行荧光标记。在荧光标记方法中的关键是特定氨基酸残基的选择（标记后可使荧光团暴露在溶液中的运动）。由于荧光团具有环境敏感性的优点筛选小分子，当阳性化合物结合引起特定氨基酸残基部位时，其构象发生变化从而引发荧光变化，可用作识别标记所在位置是否为变构位点。这个方法在Ser/Thr kinase p38α的DFG-in/out的loop上残基进行荧光标记识别了变构位点及稳定p38α无活性构象的抑制剂（55和56）[3]。

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高通量筛选法 (High-Throughput Screening, HTS)

利用HTS方法主要通过以下流程：快速筛选类药性化合物库，进而对阳性的化合物进行动力学判断是否存在变构位点，并通过复合物晶体结构解析确认变构位点和先导化合物。这个方法已成为当前使用最为广泛的变构药物发现流程。Feldman等人利用此HTS流程成功发现Caspase-7的变构位点及多个变构抑制剂Comp-A（66，图  17），Comp-B（67），Comp-C（68）和Comp-D(69）[4]。

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以片段为基础筛选方法 (Fragment-Based Screening, FBS)

虽然HTS为许多药物靶标提供大量先导化合物，但是它还是受到诸多限制，如化合物库结构覆盖率低，命中率低，难以优化等。与之相比，FBS具有高化学优化多样性，高命中率和更高的配体效率（单原子贡献亲和力值）的优点，该方法主要是利用少量低分子量的小分子母核库代替类药性化合物库，通过NMR、质谱或X-ray结构等高敏感性仪器直接筛选，识别小分子母核结合的潜在变构位点，并确立起始先导化合物。该方法已在制药行业和学术界广泛用于靶标的变构药物从头设计。Jahnke等使用含有400个母核片段的FBS方法利用NMR发现了Farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS)的变构位点和起始片段（71-74），并优化出两种有效的变构抑制剂（75,76）[5]。

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丙氨酸扫描突变法（Alanine Scanning Mutagenesis）

利用对蛋白表面上具有口袋形状区域中的敏感残基进行丙氨酸点突变扫描，能够直接识别阳性化合物的结合位点是否为变构位点，这也是当前变构位点识别的主要手段之一。Boehlein等人通过这个方法发现了玉米胚乳ADP-葡萄糖（ADP-Glc）焦磷酸化酶（AGPase）上硫酸盐离子结合的变构位点[6].

6
光亲和标记法（Photoaffinity Labeling）

光亲和标记法类似于二氧化硫捕获，不同之处只是在于引入蛋白上的是可反应的化学基团，通过光交联反应将蛋白和配体共价连接起来。同理，引入标记的氨基酸残基在所待鉴定的变构位点的位置十分重要。目前已经报道了使用光亲和标记技术鉴定出了各种生物系统中的变构位点，例如多巴胺D _2L受体，A型γ氨基丁酸，γ分泌和烟碱乙酰胆碱受体等[7]。

参考文献

1. Sadowsky JD,Burlingame MA, Wolan DW, McClendon CL, Jacobson MP, Wells JA. Turning a proteinkinase on or off from a single allosteric site via disfulfide trapping. ProcNatl Acad Sci USA 2011;108:6056–6061.

2. Ostrem JM,PetersU, Sos ML,Wells JA, ShokatKM. K-Ras(G12C) inhibitors allostericallycontrol GTP affinity and effector interactions. Nature 2013;503:548–551.

3. Simard JR,Getlik M, Grutter C, Pawar V, Wulfert S, Rabiller M, Rauth D. Development of a fluorescent-taggedkinase assay system for the detection and characterization of allosteric kinaseinhibitors. J Am Chem Soc 2009;131:13286–13296.

4. Feldman T,Kabaleeswaran V, Jang SB, Antczak C, Djaballah H, Wu H, Jiang X. A class ofallosteric caspase inhibitors identified by high-throughput screening. Mol Cell2012;47:585–595.

5. Jahnke W,Rondeau J-M, Cotesta S, Marzinzik A, Pelle X, Geiser M, Strauss A, Gotte M,Bitsch F, Hemmig R, Henry C, Lehmann S, Glickman JF, Roddy TP, Stout SJ, GreenJR. Allosteric nonbisphosphonate FPPS inhibitors identified by fragment-baseddiscovery. Nat Chem Biol 2010;6:660–666.

6. Boehlein SK,Shaw JR, Hannah LC, Stewart JD. Probing allosteric binding sites of the maizeendosperm ADP-glucose pyrophosphorylase. Plant Physiol 2010;152:85–95.

7. Lu S, Li S,Zhang J. Harnessing allostery: a novel approach to drug discovery. Med Res Rev.2014, 34(6): 1242-1285.

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