【First-in-class药设系列】通过噬菌体展示技术设计蛋白-蛋白相互作用抑制剂

      随着蛋白-蛋白相互作用在疾病发生发展中作用不断体现，其相互作用界面逐渐成为一类新的药物靶标类型。蛋白-蛋白相互作用抑制剂的设计是药物发现中的重要挑战之一，主要由于蛋白相互作用亲和力强，界面大而平坦，难以发现可以紧密结合的小分子化合物。我们之前利用肽模板方法设计了APC-Asef蛋白相互作用抑制剂设计，今天和大家介绍另外一种常见的方法，就是利用噬菌体展示技术(Phage display)进行蛋白相互作用抑制剂设计。这个工作是由基因泰克公司刚刚在今年6月的Nature chemical biology上发表，FZD7-CRD的蛋白相互作用首个小分子抑制剂。

     FZD7是FZD受体家族的一个成员，是一类跨膜蛋白。它能使干细胞介导的肠上皮细胞发生重构，且能将人类胚胎干细胞维持在未分化阶段。并且，FZD7在结肠癌，胰腺癌和胃癌中表达上调，同时在黑色素瘤中也参与肿瘤的发生和转移。在细胞表面，FZD7和Wnt，LRP5/LRP6形成三元复合物稳定β-catenin并激活Wnt下游信号。而这些上游蛋白的突变会导致Wnt通路的异常激活。因此靶向FZD受体的小分子可以将Wnt通路抑制在起始阶段。由于FZD家族的细胞外N端区域（CRD）的同源度很高导致设计选择性靶向FZD7的高亲和力的小分子是具挑战性的。近日，来自基因泰克（Genentech）公司的研究人员发现了一个特异性结合FZD7的多肽类拮抗剂，它可以将CRD稳定在非活化构象，并且能阻断FZD7在Wnt/β-catenin信号通路中的功能。

他们首先利用噬菌体展示技术从多肽库中筛选获得了5条对FZD7有结合但不结合FZD8的多肽，并进一步做了细胞功能实验。其中Fz7-21（(Ac)-Leu-Pro-Ser-Asp-Asp-Leu-Glu-Phe-Trp-Cys-His-Val-Met-Tyr-NH2）能抑制HEK293细胞（IC50=100nM）和小鼠L细胞（IC50=50nM）的Wnt-β-catenin信号。突变实验表明Cys10对于该条多肽的功能很重要。

     用5-羧基荧光素标记的Fz7-21（5FAM-Fz7-21）对FZD1，FZD2和FZD7的CRD的EC50都在nM级（19-58nM），但对其他FZD家族成员几乎没有结合。同时他们还观察到多肽能浓度依赖性地促进FZD7的二聚体化。

      之后，他们解析了hFZD7 CDR和Fz7-21的复合物晶体结构。从结构上看，多肽的结合位点临近脂质结合口袋，和脂质结合口袋以及hFZD7 CDR二聚体界面的残基都有相互作用。而多肽二聚体是两个反平行的夹角45°的α螺旋结构，中间由Cys10形成二硫键。相比于apo结构，多肽结合的hFZD7 CRD结构的脂质结合口袋的形状发生较大变化，多肽二聚体在口袋上方像是盖子一样连接两个CRD单体。为了进一步确认多肽在hFZD7 CDR上的结合位点，他们用丙氨酸扫描的方法确认了多个和hFZD7 CRD有相互作用的残基，而SPR实验也表明二聚化的Fz7-21和hFZD7CRD有紧密的结合（KD = 3 nM），同时NMR结构也说明dFz7-21呈α螺旋且存在分子间相互作用，这些结果都与晶体结构保持一致。通过结构比较和计算模拟发现hFZD7 CRD二聚体界面的结构特征和特定的氨基酸残基是Fz7-21选择性结合的结构基础。

接下来，他们探究了dFz7-21的作用机制。利用SPR方法，重构了WNT3A‒FZD7-CRD-LRP6(E3E4)三元复合物。在加入dFz7-21后，LRP6(E3E4)对WNT3A‒FZD7-CRD的结合能力降低。同时免疫共沉淀实验也表明dFz7-21可以破坏FZD1，FZD2，FZD7参与的WNT3A‒FZD-CRD-LRP6(E3E4)的形成，但对FZD4，FZD5，FZD8却没有效。为了进一步揭示了FZD7在干细胞功能的药理学作用，作者建立了类似肠上皮的类器官组织环境，用dFz7-21处理后发现腺窝处的出芽量明显减少且呈浓度依赖性，表明dFz7-21能破坏肠道干细胞的功能。对加药6h和24h的样品做RNA测序分析，结果也表明LGR5+肠道干细胞的多个生物标志物都有显著下调。

      由于FZD是一个全新靶标，其首个拮抗剂Fz7-21的发现对进一步探究FZD在干细胞和肿瘤发生过程中的作用都有巨大意义。

参考文献

1. Jiang et al. Peptidomimetic inhibitors of APC-Asef interaction block colorectal cancer migration. Nat Chem Biol. 2017 Sep;13(9):994-1001.

2. Nile et al. A selective peptide inhibitor of Frizzled 7 receptors disrupts intestinal stem cells Nat Chem Biol. 2018 Jun;14(6):582-590.

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