【First-in-class药设系列】抑制黑色素瘤的特异性STK19小分子

黑色素瘤是最危险的皮肤肿瘤，每年约有19万人被确诊，约有7000人死于该肿瘤。临床研究发现，黑色素瘤中突变高频发生于BRAF和NRAS两个基因，其中NRAS的突变约占黑色素瘤的20%-30%。相比于BRAF突变体创新药物研发进展较快不同，能够针对NRAS的有效靶向治疗方案却还没有出现，主要原因是由于RAS蛋白表面没有具有成药性的位点，使得直接靶向NRAS设计抑制剂困难重重。因此，新策略通过抑制和NRAS直接结合的调控蛋白来阻断NRAS的激活，成为了是一种可替代的治疗方案。近日，Ruitao Cui等研究人员在Cell上报道了一种能够抑制黑色素瘤的小分子抑制剂，该分子通过特异性结合NRAS的调控分子STK19来抑制黑色素瘤的恶性转变和生长，为黑色素瘤的治疗提供了新的思路。

为了能够设计NRAS的抑制剂，研究人员根据RAS蛋白结合下游因子的RAS-bindingdomain(RBD结构域)的特点，利用激酶组的siRNA干扰的方法，在HA-NRAS^Q61R细胞条件下筛选到了12个对NRAS蛋白有影响的激酶，其中STK19在之前的文献中报道过与黑色素瘤相关，但具体机制尚不明确。同时，进一步动物实验也证实了抑制STK19能够很明显降低NRAS介导的黑色素瘤形成，预示着靶向STK19有望成为克服NRAS“难靶”问题的重要突破口。

经过质谱实验和体外IP实验，研究人员确认了STK19与NRAS的相互作用，特别是与NRAS^Q61R突变型存在的相互作用。进一步质谱分析发现，STK19有可能磷酸化NRAS的S86位点。且当NRAS的S86位点发生突变时，STK19失去了使NRAS结合GTP成为激活状态的能力，并对于下游的RAF-MEK-ERK和PI3K-AKT的信号通路也不再激活。在动物实验中也同样发现NRAS的S86位点突变能够使得STK19对 NRAS介导的黑色素瘤形成作用消失。综合上述结果阐明了STK19磷酸化NRAS的S86位点，并对NRAS下游通路产生的影响。

在确认了STK19对NRAS介导的致瘤作用后，研究人员把STK19作为潜在靶标进行活性化合物筛选。他们首先应用体外NRAS作为STK19底物的体外激酶反应，建立了STK19抑制剂筛选体系，筛选并改造得到了STK19特异性抑制剂ZT-12-037-01（1a），IC₅₀为24.04nM。生化实验表明1a是STK19的ATP竞争性抑制剂，且体内模型显示1a没有改变小鼠体重，血清转氨酶水平和小鼠的组织学特征，表明该分子有较低的体内毒性。

接下来研究人员检测了1a对NRAS驱动肿瘤发展的抑制效应。他们构建了NRAS^Q61R的黑色素瘤细胞系（该细胞系可以表达STK19^wt和STK19^D89N）。在加入1a后，能明显观察到对NRAS-STK19介导的黑色素瘤克隆的抑制效果。进一步，利用在移植瘤模型的免疫荧光实验识别了1a对体内增殖和凋亡的效力。同时，细胞实验显示1a是通过抑制STK19^wt和STK19^D89N介导的NRAS磷酸化以及下游信号的激活来抑制黑色素瘤的进展。除此之外，他们证实用药后移植瘤小鼠的生存期明显延长。

在机制方面，为了验证1a是STK19的特异性抑制剂，他们用免疫印迹探究H3K9的甲基化和NRAS的磷酸化和活性水平。结果发现直到300nM，信号下游的H3K9的甲基化水平都没有改变，但NRAS的磷酸化活性却明显降低。深入研究发现，1a介导的NRAS信号抑制可以被1a耐受的STK19突变V134Y和L139F抵消，说明1a对STK19的特异性地抑制作用。

本文设计了能够靶向NRAS-STK19介导的黑色素瘤抑制剂ZT-12-037-01，该分子通过直接结合在STK19来抑制NRAS致瘤信号通路，从而抑制黑色素瘤生长。该项工作为那些难以靶向的蛋白的小分子设计提供了启示，即通过生物学研究发现可以调控“难靶”蛋白上下游的相对“易靶”蛋白，转换药物开发的靶向目标从而达到同样的药效效果。

参考文献

            1、Yin C, Zhu B, Zhang T, Liu T, Chen S, Liu Y, et al. (2019) Pharmacologicaltargeting of STK19 inhibits oncogenic NRAS-driven melanoma genesis. Cell, 176, 1113-1127. 

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