【First-in-class药设系列】GPCR系统偏置信号的靶向作用机理

G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptors，GPCRs)是人体内最多的膜蛋白，调控了从视觉，嗅觉，味觉等感觉，到神经信号，心血管系统，免疫调节等几乎所有的生理过程，也是目前药物开发的重要靶点。超过30%的FDA批准的药物都是靶向GPCR的，每年相关药物销售额达2000亿美元，超过总药物销售额的27%。但是，人类蛋白质组中总共只有826种GPCR，且其中一半左右都是嗅觉受体，数量并不多的GPCR可以精准调控如此多的过程，这与偏置信号（Biased Signaling）是分不开的，偏置信号指的是同一个GPCR在接收到不同的配体信号后，可以开启不同的下游通路，包括G蛋白和β-arrestins。由于其独有的功能选择性和克服副作用的可能，偏置信号在新药研发方面也一直备受重视。但是GPCR偏置信号的机理还没有得到清楚地阐述。近日，杜克大学医学院的研究人员在Cell上发表了对典型GPCR——血管紧张素受体1（angiotensin II type 1 receptor , AT1R）偏置信号的研究，为探究其他GPCR作用机理提供了思路，也推动了对偏置信号机制的研究。

GPCR偏置信号的模式如图所示。就AT1R而言，结合G蛋白造成血压上升，而结合β-arrestin造成心肌收缩力上升，其内源性激动剂血管紧张素是一个均等激动剂（Balanced Agonist），对两个下游信号通路同强度激活。

根据之前获得的非活化状态下的AT1R晶体结构，研究人员使用双电子-电子共振光谱学（Double Electron-Electron Resonance (DEER) Spectroscopy）测量了一些重要的残基对之间的距离，以及其在蛋白生理状态下出现的频率，用以反映AT1R主要二级结构的波动。结果显示，空载状态下的AT1R天生存在一定的构象集合，大部分距离都有两种不同状态的变化，而不是稳定在非激活态。在结合反向激动剂降压药坎地沙坦后，部分区域（如TM1-ICL2，TM7-ICL2）距离并没有发生很大变化，但ICL2-TM6和TM5-Helix8之间的距离与空载体相比变化较大。

结合内源性激动剂血管紧张素的AT1R与空载状态的AT1R相比，区别更加明显。比如TM1-TM6的距离从原来的31-34埃增加到了42埃左右，另外由ICL2-TM7的距离缩短，也可以观察到TM7的内倾。除了这些保守常见的GPCR激活方式，TM1和ICL2的靠近提示了ICL2的波动也可能是重要的激活特征。将距离波动用三边测量的方法反映到结构上以后，作者观察到TM1是相对稳定的，但TM5,6,7和Helix8波动较大。总之，血管紧张素拓宽了AT1R的构象采样空间，类似在其他GPCR中观察到的别构偶联现象。这些被扩宽的构象原来也以小的比例存在（如TM1-TM6间的长距离），符合构象选择的原理。

另外，研究人员还对非激活态的晶体体系进行了5微秒的分子动力学模拟，这直接验证了构象集合的变化。上图C的小球是动力学模拟中相应残基的位置分布，可以看出模拟和三边测量的结果是高度一致的。在动力学模拟中，也观察到了TM5外移，Helix8上移等距离测定中确定的波动情况。

之后，针对不同偏置方向的激动剂，作者分别测量了这些重要二级结构之间的距离。可以发现，G蛋白方向偏置的两个激动剂作用相似，但和血管紧张素造成的影响又不太一样。对于重要的TM1-TM6相互作用，它将长距离构象的比例从60%左右降到了40%左右。大部分的重要的与激活相关的运动在G蛋白偏置激动剂作用下也减弱了，比如说ICL2-TM7之间36埃距离出现的比例下降，以及ICL2-TM1之间的靠近。β-arrestin的偏置激动剂尽管彼此之间功能相似，产生的效应却有明显的区别。TRV026的和血管紧张素的效应区别很大，但和空载AT1R相对近似。比如说最重要的TM1-TM6相互作用，大部分居于34埃左右的较短距离，这也是apo的两个主要构象中的一个，在ICL2-TM5和ICL2-H8中，TRV026提升了很多之前次要的距离所占的比例，这与血管紧张素对这些区域带来的效应是不同的。TRV034和TRV023的状态和血管紧张素的状态很像，都促进TM6的外移。而对于第四个β-arrestin的偏置激动剂TRV027，它更像前两种的综合，既不靠近TRV026的类型，也不靠近血管紧张素的类型。

随后，研究人员使用非负矩阵分解（Non-Negative Matrix Factorization, NNMF）方法将距离分布整合成了4个主要集群，并根据每个集群的特点将其定义为某种特殊激动剂结合时的情况。NNMF1代表了TM1和TM6距离为31埃的组分，该组分主要来自空载状态，反向激动剂坎地沙坦等进一步提升了这种构象所占的比例。β-arrestin方向偏置激动剂主要导致由NNMF 2和NNMF 3组成的构象，距离分别是34和42埃，后者还具有TM1和ICL2距离为26埃的特征。血管紧张素和β-arrestin方向激动剂相比，更加稳定了NNMF4的构象集合，该集合的特征是TM6保持向外，但TM1-ICL2的距离并不位于26埃附近。G蛋白的偏置激动剂则导致AT1R更偏好NNMF4构象，根据C图，它也确实更加适合G蛋白的结合。

最终，研究人员建立了一个动态的AT1R受到偏置激动的模型。图A的相互作用距离主要基于NNMF1，表现了反向激动剂的效果。此时，TM6采取最向内的构象，关闭了G蛋白结合口袋，故命名为A_closed。图B则主要是TRV026结合时的构象，具有TM6外移，TM5内移，TM7的turn变直，以及Helix8上移的特点，此构象中，下游G蛋白配体受到阻碍不能结合，所以命名为A_occl1，与之前动力学模拟观察到的是一致的。图C主要是TRV034为代表的β-arrestin偏置激动剂的构象，特点是ICL2大幅度内移，TM6明显外移，以及TM7的内移和TM5的小幅度外移，此构象依然会阻碍G蛋白的结合，故命名为A_occl2。图D主要是G蛋白偏置激动剂的构象，特点为TM6外移，TM7内移，TM5较大地向TM6移动，虽然TM6运动与C相似，但是其中的TM5的大幅移动和ICL2的稳定让结合口袋更加适合G蛋白，所以命名为A_open。

同时，AT1R的功能与不同的配体稳定的构象具有很强的相关性。F图中可以见到，A_closed基本处于空载或者反向激动剂结合的状态，而A_occl1和A_occl2适宜于β-arrestin的结合，A_open的状态下既能激活β-arrestin的下游通路，也能激活G蛋白的下游通路。总体上，这个模型与其他GPCR研究保持了一致。比如在μ-OR和视蛋白中，G蛋白在结合时也偏好跨膜区开启较大的构象，β-arrestin的结合则偏好跨膜区比较关闭的构象。

这项工作首次给出了受偏置激动剂调节的GPCR激活状态的完整转化情况，也观察到了开启和关闭的不同构象分布，其中A_occl1和A_occl2是之前没有发现的，之后的活化晶体也没有观察到这方面的作用，因此可能是偏置作用中关键的中间态。同时，该方法对于还未获得激活和失活状态两种晶体结构的GPCR具有参考价值，可以用这种距离的测定来反映蛋白动力学，进而更好地研究其机理并做一些针对性的药物设计。在GPCR偏置激活作用在药物设计领域逐渐受到重视的今天，该工作也为深究GPCR偏置作用的机理提供了可能的途径。

参考文献：

1. Wingler, Laura M., et al. "Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations." Cell 176.3 (2019): 468-478.

2. Shimada, Ichio, et al. "GPCR drug discovery: integrating solution NMR data with crystal and cryo-EM structures." Nature Reviews Drug Discovery 18 (2018):59-82

3. Wacker, Daniel, Raymond C. Stevens, and Bryan L. Roth. "How ligands illuminate GPCR molecular pharmacology." Cell 170.3 (2017): 414-427.