【变构原创系列】变构药物发现中耐药突变的挑战与希望

与传统的正构药物（Orthosteric drug）相比，变构药物（Alloseric drug）不断表现出一些重要优点，如更高的选择性和更低的毒性，因此，变构药物在新一代治疗疾病的药物发现中具有潜在优势。值得注意的是，近年来的证据表明，由于变构位点的进化压力低于正构位点，变构位点也有可能发生耐药突变；同时，耐药性突变不仅可以发生在变构位点，而且可以发生在变构信号通路中。针对变构药物在一些重要疾病使用过程中逐渐出现的耐药性问题，已引起了药物研发者的注意。因此，针对变构位点突变的具体分子机制阐释将有利于避免耐药问题的出现，并可以促进未来的变构药物设计和优化。

    随着变构药物开发的广泛深入，耐药性突变的识别逐步成为变构药物开发所必须考虑的基本因素，也是变构新药设计面临的重要挑战。在变构药物开发中，突变的预测比正构突变要更加困难，因为正构突变仅发生在催化位点，而变构突变可能发生在变构效应起作用过程中的任何位置，包括变构调节剂结合位点，变构信号通路，以及其他对蛋白质构象稳定性至关重要的残基。通过传统实验方法发现变构突变是相当困难的。随着计算化学生物学技术的发展，已经可以在变构调控研究中进行参与残基的识别，并逐步用于阐明已有变构突变残基的机制，进而在序列，结构和动力学等方法基础上预测新的变构突变。这将有助于临床上发展通过变构药物与正构药物联合用药的双靶向疗法来克服变构耐药突变。在这里，我们选择了一些重要药物靶点的变构耐药突变机制进行剖析，并介绍几种当前发展的在克服变构耐药问题上的方法。

Bcr-Abl

Bcr-Abl融合基因产生的融合蛋白具有异常活跃的酪氨酸激酶活性，激活细胞增殖、参与持续的信号转导并抑制细胞凋亡，可以引起骨髓造血干细胞的过度增殖，导致慢性粒细胞白血病（CML）和30-50%的成人急性淋巴细胞白血病（ALL）。

    为了Bcr-Abl正构药物耐药（如T315I突变）的问题，开发了靶向C-lobe上的肉豆蔻酰结合口袋的变构抑制剂asciminib，占据了变构肉豆蔻酰结合口袋并稳定了Bcr-Abl的自抑制构象，可以克服包括T315I在内的所有正构突变，有效抑制了Abl的过度激活。临床研究表明，Bcr-Abl的治疗中出现了变构耐药的问题。一项新的体外研究提出了肉豆蔻酰基结合口袋内或附近的变构突变（例如A337V，P465S，V468F，C464W和I502L）可以造成Bcr-Abl对asciminib产生耐药 [1]。例如，C464W突变在肉豆蔻酰基结合口袋处引入了庞大的侧链，导致空间碰撞的产生，阻碍asciminib与之结合。针对这一问题，最近一项研究表明，将变构（asciminib）和正构药物（nilotinib）联合使用可解决耐药性问题，这为克服激酶耐药性提供了一种新思路 [2]。双重靶向治疗不仅可以防止变构和正构药物耐药性突变的出现，而且还可以产生累加作用，使肿瘤完全消退。这个治疗方案正在CML患者中进行2期临床试验（ClinicalTrials.gov：NCT03578367）。

MEK

    MAPK/ERK激酶（MEK）是RAS-RAF-MEK1/2-ERK通路中的一环，该通路可被多种细胞外刺激激活，引起不同的细胞内反应，包括细胞增殖、存活和迁移，其中发生的功能获得性突变被认为是肿瘤进展的重要驱动因素。尽管MEK本身不是一个容易发生突变的激酶，RAF或RAS突变可以激活下游的MEK，从而放大MAPK信号。因此，MEK成为了阻断这一通路、治疗癌症的理想靶点。

    当前可用的MEK抑制剂都是变构的，包括trametinib，cobimetinib和binimetinib，主要用于治疗BRAF V600E突变的黑色素瘤患者。在MEK上，变构位点是在α-helix C打开的情况下，α-helix C与活化环之间的空间增大而形成的，而这些变构药物结合后可以将MEK1稳定在αC-out的失活构象。尽管这些药物显著提高了患者的生存率，但临床上发现变构突变造成了患者耐药。这些突变主要包括两种不同的分子机制：（1）变构结合口袋内部的突变直接降低药物的亲和力。同源建模和分子动力学模拟表明，位于变构位点的芳胺结合口袋内的MEK1 “守门员”突变V211D，疏水性氨基酸V211被非疏水性D211取代，失去了与抑制剂相互作用的疏水性碳原子。此外，研究人员还揭示了其他聚集在芳基胺结合口袋内部的变构突变，如I99T，L115P / R，F129L和L215P。（2）与α-helixC相邻的突变通过改变α-helix C的构象引起耐药性的产生，这些突变包括I103N，K104N，I111N，H119P，E120D和F133L。另外，在β3-αC环上⁹⁸LIHLEIK¹⁰⁴氨基酸发生缺失的突变体（例如，ΔL98-I103，ΔE102-I103，ΔI99-K104和ΔI103-K104）也会减小β3-αC环的长度，从而影响α-helix C的打开。尽管变构耐药性问题日趋严重，但上述变构突变体的激酶活性仍可以被ATP竞争性的正构抑制剂所抑制。因此，新开发的正构抑制剂可以为用变构抑制剂治疗后产生耐药性的患者提供合理的治疗策略 [3]。

SHP2

    SHP2（SRC homology 2 domain-containing phosphatase 2）是含有两个SH2（SRC homology 2）结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶，是多种生长因子和细胞因子信号通路中的关键下游调节因子，主要通过激活RAS-ERK信号通路在细胞增殖和存活中发挥关键作用。然而，上游蛋白酪氨酸激酶（PTKs）发生突变，引起的SHP2过度激活可以导致多种肿瘤的发生，包括白血病和多发性实体瘤。因此，抑制SHP2活性是肿瘤治疗的重要靶点。

    由于SHP2的正构位点所含残基极性强、亲水性较高，正构药物设计面临着巨大的挑战。经过高通量筛选偶然发现了SHP2变构抑制剂，优化产生的SHP099被鉴定为有效的高选择性SHP2变构抑制剂，可与三个结构域（PTP，N-SH2以及C-SH2）共同组成的隧道状变构位点结合，从而将SHP2稳定在自抑制构象。然而，SHP099在应用中也出现了变构耐药问题。研究表明， N-SH2 / PTP界面上可能发生功能获得性突变，使SHP2对SHP099的敏感性大大降低 [4]。对COSMIC数据库的进一步检查表明D61，E76和A72是临床上最常见的突变变构残基，典型的突变包括D61Y，A72V和E76K。变构耐药性产生的主要机理是：这些变构突变导致自抑制构象稳定性降低，增加了开放态构象的数量。例如，E76K突变破坏了对N-SH2 / PTP相互作用至关重要的氢键（E76-S502）和盐桥（E76-R265）。所以，当前研究的重点应放在发现克服常见耐药性问题的新型变构抑制剂上。最近新开发的一种变构抑制剂Compound 23就可以有效靶向SHP2 E76A突变体 [5]。

    针对日益紧迫的变构耐药问题，国内外研究人员发展了多种方法来识别变构突变，为克服耐药的药物设计提供解决方案，下面介绍三种目前应用最为广泛的方法：

AlloDriver

    AlloDriver是上海交通大学医学院张健等开发的识别变构突变的方法，它基于约7,000份临床肿瘤样本中的囊括了33种肿瘤类型的47,000多种错义体细胞突变，并将这些突变投射于三维模型中，可以用于识别和分析变构位点的肿瘤相关的体细胞突变，在PDE10A、PTPRK等多个体系中有效地发现了变构突变[6]，这一方法将有助于利用突变对克服耐药的变构药物进行筛选与优化。

SBSMMA

    基于结构的变构统计力学模型（SBSMMA，structure-based statistical mechanicalmodel of allostery）是新加坡A-STAR研究所Igor等开发的识别变构通路的方法，可用于预测变构信号转导的结果和过程中的能量变化，有助于观察潜在的变构耐药性突变。他们继而开发了AlloSigMA，为SBSMMA提供公开使用的自由能计算的框架，并且可以检测变构突变引起的正/负效应 [7]。为了避免用户大量计算，他们将基于SBSMMA 结果放置在AlloMAPS数据库，包含大约2000个不同蛋白质和蛋白质链的完整变构信号转导机制图，还可以评估每个突变的变构作用 [8]。

临床双靶向疗法

    除了上述计算化学生物学方法外，临床上针对不同靶标的研究表明，变构和正构药物联合给药可以将蛋白构象稳定在所需状态，从而大大推迟变构和正构位点的耐药突变。双重靶向治疗具有预防耐药性的作用，并具有出色的治疗效果，因此正在针对多种疾病进行临床试验。例如，asciminib和imatinib联合使用可以初步解决Bcr-Abl的耐药性问题 [2]，而osimertinib与JBJ-04-125-02联合用药可以防止EGFR中耐药性突变的出现 [9]。

    综上，随着变构药物不断上市，其在使用过程中所面临的耐药问题逐步显现，已成为新一代药物开发过程中必须要考虑的重要挑战。利用计算和实验方法结合发现变构突变，结合正构和变构药物联合用药将为解决这一问题提供新的希望。更完整信息请关注张健课题组Drug Discovery Today上关于变构突变的评述“Emergence ofallosteric drug-resistance mutations: new challenges for allosteric drugdiscovery”。

https://doi.org/10.1016/j.drudis.2019.10.006

参考文献

[1]      Qiang, W. etal. (2017) Mechanisms of resistance to the BCR-ABL1 allosteric inhibitorasciminib. Leukemia 31, 2844–2847

[2]      Wylie, A.A. et al.(2017) The allosteric inhibitor ABL001 enables dual targeting of BCR-ABL1. Nature543, 733–737

[3]      Gao, Y. et al. (2018)Allele-specific mechanisms of activation of mek1 mutants determine theirproperties. Cancer Discov. 8, 648–661

[4]      Chen, Y.N.P. et al.(2016) Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven byreceptor tyrosine kinases. Nature 535, 148–152

[5]      Sun, X. et al. (2018)Selective inhibition of leukemia-associated SHP2 E69K mutant by the allostericSHP2 inhibitor SHP099. Leukemia 32, 1246–1249

[6]      Song, K. et al.(2019) AlloDriver: a method for the identification and analysis of cancerdriver targets. Nucleic Acids Res. 47, W315–W321

[7]      Guarnera, E. et al.(2017) AlloSigMA: Allosteric signaling and mutation analysis server. Bioinformatics33, 3996–3998

[8]      Tan, Z.W. et al.(2019) AlloMAPS: Allosteric mutation analysis and polymorphism of signalingdatabase. Nucleic Acids Res. 47, D265–D270

[9]      To, C. et al. (2019)Single and dual targeting of mutant EGFR with an allosteric inhibitor. CancerDiscov. 9, 926-943