【First-in-class药设系列】溶酶体相关新型靶标的药物发现
溶酶体(lysosomes)是真核细胞中的一种细胞器，最初由德杜费(ChristiandeDuve)于1955年在鼠肝细胞的电镜观察中首次发现。其内含多种水解酶，专司分解各种外源及内源大分子物质，在降解和回收细胞废物，细胞信号传导以及能量代谢中起重要作用。溶酶体与人类疾病有着较密切的关系，溶酶体异常会引发多种疾病。过去发现编码溶酶体蛋白的基因缺陷会导致溶酶体贮积病（LSDs），并且已成功开发出相应的酶替代疗法（ERT）。
越来越多的证据还表明溶酶体功能障碍在更常见的疾病中起作用，包括炎性和自身免疫性疾病，神经退行性疾病，癌症和代谢性疾病。但是，迄今为止，用小分子和肽类药物直接靶向溶酶体的研究却较少被关注。随着对疾病中溶酶体功能和功能障碍的研究不断深入，直接特异性靶向溶酶体的治疗策略有新的机会出现。今天和大家分享一下针对溶酶体蛋白和生物过程的靶向治疗的研究进展和药物发现机会[1]。
众所周知，溶酶体通过内吞和吞噬作用对细胞外物质进行降解和再循环，在细胞内则主要通过自噬发挥作用。这些过程的降解产物既可以被运输到高尔基体供重复利用也可以通过胞吐从细胞中释放，这意味着溶酶体能广泛地参与到免疫反应中。此外，借助于mTORC1，溶酶体可以在细胞的营养感测以及能量代谢控制中起关键作用，进而影响质膜修复，骨吸收，免疫反应，病原体的消除等。
溶酶体是承担细胞自噬功能的主要细胞器，是消化大自噬，小自噬和分子伴侣介导自噬（CMA）产生的细胞废物的最终细胞器。脂滴(LDs)与PLIN2/3蛋白结合，在伴侣HSPA8的帮助下被AMPK磷酸化，进而通过大自噬途径进行降解。mTORC2和AKT则在饥饿的情况下，通过PHLPP的调控，对CMA的易位复合物进行负调节。TFEB与CLEAR基序结合可以调控溶酶体基因的转录。溶酶体表面高度糖基化，借助于这些膜上的糖蛋白，有助于保护自身不被酶水解。溶酶内的所有水解酶在pH值=5左右时活性最佳，因此需要vATPase维持内腔的酸性。其他关键的溶酶体蛋白还包括结构蛋白LAMP1，转运蛋白LAMP2A，离子通道TRPML等。
成熟溶酶体的形成是一个复杂的过程，自噬过程的完成依赖于溶酶体各种水解酶的通力合作。因此，其活性的任何失调都可能导致细胞代谢机制的各种元素(糖、脂质、蛋白质和核酸)以及代谢途径、吞噬、内吞和自噬的损害。虽然潜在的机制还远未完全阐明，但已发现溶酶体功能障碍可影响其他细胞器的正常活动，如过氧化物酶体和线粒体，导致产生过量反应性氧化物，具有与衰老、癌症、慢性炎症、神经系统疾病、自身免疫性疾病相关的病理特征。
疾病 | 溶酶体功能障碍 | 备注 |
溶酶体储存障碍 | ||
天冬氨酰葡萄糖胺尿症 | 天冬氨酰氨基葡糖苷酶 | 未修饰的天冬氨酸氨基葡萄糖在溶酶体中的储积导致人类骨骼和结缔组织异常 |
α-甘露糖苷贮积症 | α-D-甘露糖苷酶 | MAN2B1基因突变引起的α-D-甘露糖苷酶缺引起甘露糖苷蓄积 |
Fabry病 | α-半乳糖苷酶 | α-半乳糖苷酶缺陷引起三聚己糖神经酰胺在多种组织的细胞溶酶体中蓄积 |
Gaucher病（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型） | β-葡萄糖苷酶 | 由于葡糖脑苷脂酶的缺乏而引起葡糖脑苷脂在肝、脾、骨骼和中枢神经系统的单核-巨噬细胞内蓄积 |
GM1神经节苷脂贮积症 | β-半乳糖苷酶 | GM1神经节苷脂在溶酶体内的异常蓄积导致人类骨骼和神经功能障碍 |
krabbe病 | 半乳糖脑苷-β-半乳糖苷酶 | 半乳糖脑苷-β-半乳糖苷酶缺乏，导致脑白质内有许多半乳糖脑苷蓄积 |
异染性脑白质营养不良 | 芳基硫酸酯酶A或神经鞘脂激活蛋白B | 酶缺陷导致硫酸半乳糖基酰基鞘氨醇在主要器官中蓄积 |
黏多醣贮积症 | 参与粘多糖分解代谢的酶 | 溶酶体内粘多糖的蓄积导致人类骨骼和关节异常 |
多发性硫酸酶缺乏症 | SUMF1 | 包括硫酸化糖胺聚糖在内多种多糖的异常蓄积导致人类神经变性和精神运动迟缓 |
Pompe病 | α-葡萄糖苷酶 | 在人类的肌肉和周围神经中观察到未降解糖原的蓄积 |
GM2神经节苷脂沉积症 | β-氨基己糖苷酶A和B | 酶缺陷导致GM2神经节苷脂在溶酶体中蓄积，从而导致人类神经系统损伤 |
粘脂病(Ⅱ型和Ⅲ型) | N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸转移酶α和β | 酶缺乏导致非磷酸化糖蛋白的蓄积，从而导致人类的运动功能和神经功能障碍 |
粘脂病(Ⅳ型) | 粘脂蛋白1 | 溶酶体膜蛋白缺陷导致粘多糖和脂质的蓄积，从而导致人类的肝脾肿大、形态异常以及其他神经系统疾病 |
胱氨酸尿症 | 半胱氨酸转运蛋白 | 溶酶体转运蛋白的缺陷导致胱氨酸在不同器官中蓄积 |
Danon病 | LAMP2 | LAMP2缺陷导致糖原和其他自噬成分在人类心肌细胞中蓄积，从而导致心脏疾病 |
游离唾液酸储存障碍 | 唾液酸转运蛋白 | 唾液酸转运蛋白的缺陷导致游离唾液酸在器官中蓄积，最终导致人类不同的疾病 |
NPC1 | 参与脂质运输的膜蛋白 | NPC1和NPC2蛋白的缺陷导致溶酶体中胆固醇和糖苷脂的蓄积，并导致人类的肝、肺和神经障碍 |
NPC2 | 可溶性胆固醇结合蛋白 | |
自身免疫性疾病 | ||
SLE | 溶酶体成熟缺陷 | 在狼疮(MRL/Lpr)小鼠中观察到溶酶体成熟受损的巨噬细胞 |
SJS | 溶酶体酶(糖苷酶和蛋白酶)异常高 | 在MRL/Lpr小鼠SGS中观察到自噬缺陷 |
Crohn病 | 溶酶体Ph异常 | 在小鼠和人类中都观察到GPR65下调 |
类风湿性关节炎 | 溶酶体水解酶 | 人类不同的组织蛋白酶、酸性磷酸酶等参与炎症和关节损伤 |
CIDP | 溶酶体CMA途径的改变 | 在小鼠坐骨神经中观察到LAMP2A表达增加
|
硬化症 | 溶酶体酸化 | 溶酶体缺陷导致人类神经细胞中脂滴降解缺陷 |
ALS | 内体性溶酶体转运缺陷 | 模拟人类脊髓疾病对的小鼠模型显示溶酶体功能障碍和有丝分裂受损 |
神经退行性疾病 | ||
阿尔兹海默症 | 溶酶体内pH不平衡 | 在溶酶体酸化的情况下观察到V-ATPase功能缺陷；溶酶体非特异性组织蛋白酶产生β-淀粉样蛋白和过度磷酸化tau蛋白 |
帕金森病 | 溶酶体CMA途径的改变 | 溶酶体中GCase的选择性丢失与LAMP2A的减少以及组织蛋白酶A和D的增加有关 |
亨廷顿病 | 溶酶体转运途径的改变 | 亨廷顿蛋白积聚改变了小鼠溶酶体酶活和TFEB表达；此外，脂褐素(不可降解的溶酶体内聚合物)在神经元溶酶体中的蓄积减弱了溶酶体的功能 |
目前，报道过的特异性靶向自噬过程的激动剂和抑制剂非常少，特异性靶向溶酶体的小分子更是少之又少，虽然为特定LSDs开发的小分子药物（包括底物还原疗法和小分子伴侣疗法）已经上市多个，但用于其他更常见疾病的小分子候选药物则还处于早期开发阶段。这些分子能更特异地作用于溶酶体，其中一些是通过高通量筛选发现的，主要针对LAMP2A，各种溶酶体酶（如组织蛋白酶，酸性鞘磷脂酶，α-半乳糖苷酶A，酸性β-葡萄糖脑苷酶等），伴侣（如HSPA8和β-N-乙酰己糖胺酶）。虽然不只存在于溶酶体中，但调控溶酶体内腔pH的V-ATPase以及阳离子通道TRPML1也是被关注的靶标。
药理试剂/公司 | 机制 | 研发状态 | 备注 |
LSD底物减少疗法 | |||
Miglustat/美格鲁特 爱可泰隆 | GCS抑制剂 | 上市 | 用于各种LSDs，Gaucher病和NPC |
Eliglustat/依鲁司他 健赞 | GCS抑制剂 | 上市 | 不跨越血脑屏障；用于非神经病理性Gaucher病；在Ⅰ型Gaucher病中优于Miglustat和其他治疗方法 |
Lucerastat Idorsia Pharmaceuticals | GCS抑制剂 | II期临床 | 副作用较小的Miglustat类似物；对Fabry病患者具有高度耐受性；对GM2神经节苷脂病小鼠模型有效，改善了神经功能 |
Ibiglustat 健赞 | GCS抑制剂 | II期临床 | 在Fabry病、III型Gaucher病和帕金森病中进行了临床评估 |
Genistein/染料木素 | 激酶抑制剂 | III期临床 | 抑制III型黏多糖病患者体内成纤维细胞中的糖胺聚糖 |
IVA336 Inventiva Pharma | 糖胺聚糖储积抑制剂 | II期临床 | 改善IV期黏多糖病老鼠的临床症状；与酶替代疗法相比具有更好的生物分布；正在进行IV期黏多糖病患者的II期临床试验(NCT03370653) |
LSD分子伴侣疗法 | |||
Migalastat/米加司他 爱美医疗 | 辅助α-半乳糖苷酶A的构象 | 上市 | 治疗Fabry病；对大多数GLA基因突变患者有效 |
Afegostat 爱美医疗 | β-葡萄糖苷酶抑制剂 | II 期临床失败 | 结合到葡萄糖脑苷酶N370S突变体；协助酶从内质网到溶酶体的折叠和运输 |
Pyrimethamine | β-己糖苷酶的竞争性抑制剂 | I 期临床 | 对桑德霍夫和泰萨克斯疾病有效；选择性结合到β-己糖苷酶中区域II的活性位点 |
Ambroxol/氨溴索 勃林格殷格翰 | 对β-葡萄糖苷酶pH依赖性影响 | 于II期临床暂停 | 在Gaucher病中有效，改善神经症状 |
N-Octyl-β-valienamine | β-葡萄糖脑苷脂酶抑制剂 | 临床前 | 适用于Gaucher病的N-octyl-4-epi-β-valienamine的差向异构体 |
N-Acetylcysteine | 以pH和温度依赖的方式辅助α-葡萄糖苷酶 | 临床前 | Pompe病中的变构伴侣 |
5-(4-(4-Acetylphenyl) piperazin-1-ylsulfonyl)- 6-chloroindolin-2-one | 酸性α-葡萄糖苷酶抑制剂 | 非亚胺糖伴侣；对酸性α-葡萄糖苷酶有最高伴侣活性 | |
1-Deoxynojirimycin 爱美医疗 | 酸性α-葡萄糖苷酶抑制剂 | II期临床 | 有效对抗酸性α-葡萄糖苷酶的各种突变 |
α-Lobeline and 3,4,7- trihydroxyisoflavone | β-半乳糖脑苷脂酶 | 临床前 | 对Krabbe病患者成纤维细胞有效 |
N-Octyl-4-epi- β-valienamine | 维持β-半乳糖苷酶催化活性 | 临床前 | GM1神经节苷脂病小鼠模型中有效 |
5N,6S-(N'-butylimino- methylidene)-6-thio-1- deoxygalactonojirimycin | β-半乳糖苷酶的竞争性抑制剂 | N′-Butyl基团选择性地结合到β-半乳糖苷酶的活性位点；保护酶不因温度波动而降解；用于Gm1神经节苷脂病
| |
NCGC607 | 辅助葡萄糖脑苷脂酶的活性构象 | 在细胞检测中溶酶体底物储积和α-突触核蛋白水平的降低
| |
溶酶体酸化抑制剂 | |||
Chloroquine（CQ） | 抑制溶酶体酸化 | 工具化合物/ IV期临床 | 增加Treg细胞扩展，缓解EAE症状；已完成自身免疫性肝炎的IV期临床试验(NCT01980745) |
Hydroxychloroquine（HCQ） | 抑制溶酶体酸化 | 工具化合物/ IV期临床 | 在SLE，RA,SJS及其他疾病中阻断自身免疫性T细胞反应；在SLE (NCT00413361),SJS (NCT01601028), RA (NCT03085940) 处于IV期临床 |
NH4Cl | 抑制溶酶体酸化 | 工具化合物 | N/A |
Monensin/莫能菌素 | 抑制溶酶体酸化 | 工具化合物 | N/A |
mTOR抑制剂 | |||
Rapamycin/雷帕霉素(sirolimus/西罗莫司) | 与FKBP12结合，变构抑制mTOR | 工具化合物 | 用于治疗包括SLE和RA等多种疾病 |
组织蛋白酶抑制剂 | |||
CA030，CA-074及其类似物 | 组织蛋白酶B抑制剂 | 临床前 | 与骨性关节炎患者比，RA患者组织蛋白酶B增加；在小鼠黑色素瘤转移方面也有可观的结果 |
Pepstatin A | 组织蛋白酶D抑制剂 | 工具化合物 | 在CKD小鼠模型中减少肾纤维化 |
α1-Antichymotrypsin and phenylmethyl- sulfonyl fluoride | 组织蛋白酶G抑制剂 | 临床前 | 与骨性关节炎患者比，RA患者组织蛋白酶G增加 |
CLIK-148,CLIK-181和CLIK-195 | 组织蛋白酶L抑制剂 | 临床前 | 通过体外和体内研究获得的抑制剂；与骨性关节炎患者比，RA患者组织蛋白酶L增加；siRNA介导的抑制保护小鼠免受自身免疫性糖尿病 |
LHVS和CLIK-60 | 组织蛋白酶S抑制剂 | 临床前 | 在小鼠SJS模型中抑制自身抗原呈递 |
RO5461111 罗氏 | 组织蛋白酶S抑制剂 | 临床前 | 通过抑制自身抗原呈递缓解SLE和SJS |
CLIK-164和SB-357114 葛兰素史克 | 组织蛋白酶K抑制剂 | 临床前 | 在骨质疏松症中减少胶原降解 |
L-006235 | 组织蛋白酶K抑制剂 | 临床前 | 在大鼠关节炎模型中表现镇痛作用 |
PADK，SD1002和SD1003 | 组织蛋白酶B和L抑制剂 | 临床前 | 通过抑制组织蛋白酶B和L进而减少阿尔茨海默症的蛋白储积 |
V-ATPase抑制剂 | |||
Bafilomycin A1 | 从灰色链霉菌中分离出的一种大环内酯类抗生素；选择性抑制溶酶体内V0 c亚基 | 工具化合物 | 通过抑制自噬过程和通过线粒体激活凋亡途径来缓解淋巴细胞白血病 |
Concanamycin A | 从链霉菌分离的一种大环内酯类抗生素；选择性抑制溶酶体内V0 c亚基 | 工具化合物 | N/A |
FR167356 | 破骨细胞ATPase的选择性抑制剂 | 临床前 | 对骨质疏松症和转移性骨病有效 |
Salicylihalamide A | 首次从海洋Haliclona中分离得到；通过V0结构域选择性抑制哺乳动物ATPase | 工具化合物/临床前 | 通过抑制V-ATPase发挥抗癌作用 |
Saliphenylhalamide | 合成分子；抑制ATPase | 临床前 | 衍生物在癌细胞系中具有抗癌作用 |
SB 242784 SmithKline Beecham Biologicals | 合成分子；抑制ATPase | 临床前 | 选择性抑制破骨细胞的V-ATPase，缓解骨质疏松症和转移性骨病的临床症状 |
BRD1240 哈佛大学 | 小分子；通过抑制ATPase发挥溶酶体酸化作用 | 工具化合物 | 通过抑制溶酶体酶发挥抗癌作用 |
离子通道调节剂 | |||
ML-SA1 | TRPML1激动剂 | 工具化合物/临床前 | 在溶酶体胞吐中起重要作用；诱导溶酶体酸性磷酸酶的分泌和LAMP1的表达 |
SF-22 | TRPML1/3 激动剂 | 临床前 | 可用于疫苗、自身免疫性疾病和传染病的治疗(WO2015118167A1) |
MK6-83 | TRPML1激动剂 | 临床前 | N/A |
PIK激酶调节剂 | |||
YM-201636 | PIKfyve激酶抑制剂 | 临床前 | 用于抗逆转录病毒治疗；抑制脂肪细胞中的葡萄糖内流 |
Apilimod AI Therapeutics | PIKfyve激酶抑制剂 | I 期临床 | 在自身免疫性疾病中抑制辅助性T细胞1和辅助性T细胞17的应答 |
伴侣调节剂 | |||
P140 peptide ImmuPharma | CMA抑制剂 | III期临床 | 结合HSPA8并阻断SLE，SJS和CIDP中失调的伴侣介导活动 |
VER-155008 | HSP70抑制剂 | 工具化合物/临床前 | 在肺癌和阿尔兹海默症中有治疗效果 |
Humanin（HN） | CMA激动剂 | 临床前 | 与HSP90结合以促进底物易位的线粒体相关肽 |
其他 | |||
Lonafarnib/洛那法尼 Eiger BioPharmaceuticals | 溶酶体激动剂 | 临床前 | 一种已知的抗癌分子；抑制法尼基转移酶并通过激活溶酶体降解过程减轻小鼠疾病；可能的神经退行性疾病的治疗选择 |
同时，可以预见未来溶酶体为靶向治疗策略会被越来越多研究，为了建立国际化标准化的溶酶体-自噬研究标准，使全球研究人员之间的学术交流更易理解，下面对一些溶酶体研究过程中的测试试验进行了总结。这些表征自噬过程激动剂和抑制剂以及溶酶体效应的检测方法都已经得到了验证，但是每种测定法都有固有的偏差，因此有必要使用几种独立的体外和体内方法来交叉验证。
溶酶体表征 | 方法 | 备注 |
总体积(数量和大小) | 流式细胞术或荧光显微镜 | 简单易用，但不能定量，可适应临床试验设置
|
Western blot或荧光成像 | 简单，但不提供有关亚细胞群体的信息，可适应临床试验设置 | |
电镜 | 提供形态信息，但费力且半定量 | |
生物发生和激活状态 | TFEB的Western blot和qPCR | 简单，但不提供有关亚细胞群体的信息；可适应临床试验设置 |
TFEB-GF核易位的荧光成像 | 在原代细胞中的使用受到限制 | |
pH | 用LysoSensor Y ellow/Blue92,221或Oregon- Green 488进行比率荧光检测 | 染料可能对溶酶体产生碱化作用，并影响结果的准确性 |
降解能力 | 荧光检测BSA的降解 | 需要通过内吞作用将BSA分子装载到溶酶体中，并且可能干扰正常的溶酶体功能 |
蛋白酶表达 | Western blot | 简单，但不提供有关亚细胞群体的信息；可适应临床试验设置 |
蛋白酶活性 | 用Magic Red Cathepsin (B, K and L)试剂盒测定组织蛋白酶底物裂解的荧光 | N/A |
膜稳定性 | 吖啶橙膜稳定性试验 | 光毒性 |
膜完整性 | 溶酶体半乳糖凝集素斑点试验 | N/A |
细胞分级法检测胞浆中溶酶体含量 | 灵敏度有限 | |
局部钙水平 | GCaMP3-ML1的活细胞成像 | 在原代细胞中的使用受到限制 |
综上，溶酶体在疾病发生发展中发挥的重要作用，多类溶酶体相关蛋白均有望成为药物研发的新型靶标。另一方面，我们仍需更多的研究来表征与溶酶体特异性关联的成分（如LAMP2A和HSPA8），并更清楚地定义它们在溶酶体生理过程中的作用。此外，以溶酶体为靶标的药物的给药方式也应被特别注意，以最大程度地减少毒性并促进特异性靶向。希望此类研究未来能够在更广阔的治疗应用领域中出现，包括罕见和常见的自身免疫性疾病，神经退行性疾病和代谢性疾病，以及癌症，衰老等。
参考文献
Bonam,S.R.; Wang, F.; Muller, S. Lysosomes as a therapeutic target. Nat. Rev. Drug Discov. 2019, 1–26.