【First-in-class药设系列】瑞德西韦(Remdesivir)的前世-针对埃博拉病毒的治疗

    在2013-2016年，西非爆发了有史以来规模最大，情况最复杂的埃博拉疫情。报道的病例超过2.8万例，其中死亡病例数超过1.1万；此外，埃博拉疾病（EVD）也造成了相关的后遗症，如关节和肌肉疼痛，以及神经、眼部的症状和性疾病幸存者的病毒持续感染和复发。埃博拉病毒（EBOV）是一种来自丝状病毒科的单股负链不分节段RNA病毒。除了EBOV之外，其他相关病毒，即马尔堡病毒、苏丹病毒和本迪布焦病毒，也造成了高致死率的暴发。尽管在西非埃博拉疫情爆发期间，各种实验性小分子和生物制剂的疗效已经在EVD动物模型和多个临床试验中得到评估，但当时还没有兼顾临床疗效和安全性可用于治疗急性EVD或其后遗症的治疗方法。

    1’-氰基取代的腺嘌呤c -核苷核糖类似物（Nuc）对多种RNA病毒具有抗病毒活性。Nuc的作用机制是通过细胞内的代谢，合成活性产物——三磷酸代谢物(NTP)，而NTP可以干扰病毒RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）的活性。在结构上，1 -氰基为病毒RNA聚合酶提供了效力和选择性，但由于化合物单磷酸化的动力学速率慢，使用单磷酸修饰的亲本核苷有可能大大提高细胞内NTP浓度。瑞德西韦（GS-5734）来自于是吉利德科学公司在研药品，是2-乙丁基L-丙氨酸氨基磷酸酯前药的单一Sp异构体，有效地绕过了限速步骤，Nuc的单体磷酸化。

    在人单核细胞来源的巨噬细胞中，加药GS-5734，观测到胞内NTP水平迅速升高（胞内NTP浓度高于加药Nuc30倍），去除培养基中的GS-5734后，半衰期（t_1/2）持续24小时。在细胞检测中，GS-5734对包括马尔堡病毒和几种EBOV变种在内的多种丝状病毒都有活性。GS - 5734在多个相关的人类细胞类型（主要包括巨噬细胞和内皮细胞）内抑制EBOV的复制，半峰有效浓度（EC₅₀）值为0.06到0.14μM。而如预料之中的，Nuc的EC₅₀活性较差，为0.77到＞20μM。研究人员用GS-5734处理在西非疫情期间分离到的EBOV感染的肝Huh-7细胞，结果显示病毒RNA产量和传染性病毒产量出现了显著的剂量依赖性下降。GS-5734和Nuc抑制了一系列的人类RNA病毒病原体的复制，包括呼吸道合胞体病毒(RSV)、朱宁病毒、拉沙热病毒和中东呼吸综合征病毒，但对甲病毒或逆转录病毒无效。之前的研究报道了Nuc对黄病毒、副流感病毒3型和严重急性呼吸综合征相关冠状病毒的活性，但对西尼罗病毒、甲型流感或柯萨奇病毒的活性很少或没有。GS-5734的抗病毒活性是有选择性的，这在许多人类原代细胞和细胞系中得到了证实。

Left:

Left: Antiviral activity of GS-5734 in HeLa cells against EBOV Makona (black symbols), EBOV Kikwit (open symbols), Marburg (red), Bundibugyo (orange), Sudan (blue) viruses; Right: Inhibition of RSV RdRp (blue), but not human RNA Pol II (black) or mitochondrial RNA (red) polymerases by NTP

    EBOV RdRp的分离和表达一直难以实现，但其催化棕榈子域的计算分析表明其与RSV RdRp具有高度的序列和结构同源性。这与之前提出的作用机制一致，NTP通过整合新生病毒RNA转录并导致其提前终止，从而抑制RSV RdRp催化的RNA合成。相比之下，NTP对人类RNA聚合酶没有抑制作用。这些数据表明GS-5734在胞内高效转化为NTP后通过靶向EBOV的RdRp和抑制病毒RNA合成来选择性地抑制EBOV的复制。

    因为许多啮齿动物体内存在高水平的血清酯酶活性，会降低GS-5734的活性，并对其药代动力学特征产生不良影响，所以啮齿动物模型不适用于GS-5734的体内药效评价。而恒河猴与人类一样，不表达高水平的血清酯酶；恒河猴淋巴细胞在体外有效地激活了GS-5734，尽管NTP水平相对于人类细胞有所降低。在恒河猴中，肌肉注射临床上衍生的野生型EBOV会产生一种暴发性致死疾病，其病理生理反应与人类EVD病例极为相似，非人类灵长类动物(NHP)被认为是最相关的EVD模型，非常适合在感染人类的试验不可行的情况下评估抗病毒干预的有效性。

a. Pharmacokinetics following intravenous administration of 10 mg kg−1 GS-5734 dose in healthy rhesus macaques (mean ± s.d., n = 3). Plasma GS-5734 (black), alanine metabolite (red), and Nuc (blue); NTP in PBMCs (green). b, Tissue distribution of [14C]GS-5734 and metabolites at 4 h (blue) and 168 h (red) following intravenous 10 mg kg−1 GS-5734 dose in healthy cynomolgus macaques (mean ± s.d., n = 3). c, Experimental design for GS-5734 efficacy evaluations in rhesus monkeys. No Tx, no treatment.

    在NHPs中检测GS-5734的药代动力学、代谢和分布，对恒河猴静脉注射10 mg/kg 剂量后，GS-5734显示出较短的血浆半衰期（t_1/2 = 0.39 h），系统迅速消除GS-5734（Black），随后关键的胞内中间丙氨酸代谢物(Red)的瞬时系统水平升高后迅速下降，以及更多的Nuc（Blue）和NTP（Green）的持续水平。GS-5734迅速进入外周血单核细胞(PBMCs)，在给药2小时内，NTP的有效转化率明显提高。在PBMCs中，NTP是主要的代谢物，其持续时间为t_1/2 （14h），而>50%病毒抑制时间为24h。在食蟹猴体内，静脉注射10 mg/kg剂量[14C]GS-5734表明，同位素示踪显示药物来源的物质在给药后4小时内分布于睾丸、附睾、眼睛和大脑。与其他组织相比，4小时时的脑内水平较低，但在给药168小时后仍高于药物血浆水平。综上所述，药代动力学分析表明，每天一次剂量的GS-5734可提供持续的细胞内NTP水平，并有效地将药物代谢产物运送到病毒可能持续存在的避难所。

d, Kaplan–Meier survival curves. *P < 0.05 for treatment versus vehicle groups assessed by log-rank analysis using Dunnett–Hsu procedure to adjust for multiple comparisons. e, Group geometric mean of plasma viral RNA concentrations; LLOQ, lower limit of quantitation; LOD, limit of detection. f, Individual plasma viral RNA in vehicle (blue) or 10 mg kg−1 GS-5734 (black) groups. g, Group average clinical disease score. d, e, g, Black (open symbols), vehicle; red, 3 mg kg−1 d0; green, 3 mg kg−1 d2; blue, 10/3 mg kg−1 d2; orange, 10/3 mg kg−1 d3; black (closed symbols), 10 mg kg−1 d3; n = 6 animals per group. Error bars omitted for clarity (e, g); x axes truncated to emphasize acute disease phase (f, g).

    为了评估GS-5734的体内疗效，研究人员对感染了埃博拉病毒的恒河猴进行了一项连续的两部分适应性设计研究。在第一部分中，肌肉注射了EBOV的动物接受了为期12天的安慰剂治疗（n = 3）或3mg/kg的GS-5734于开始第0天（d0；病毒注射后30-90分钟）或第2天（d2）。不管起始时间如何，GS-5734的治疗通过降低相对于安慰剂组的系统性病毒血症而产生抗病毒效果，并且在3 mg/kg d0组中提高了33%的存活率，在3 mg/kg d2组中提高了66%的存活率，然而，在两个治疗组中观察到的死亡率表明，3 mg/kg的剂量可以进一步优化。在疗效研究的第二部分中，GS-5734以10 mg/kg的负荷剂量给药一次，然后以3 mg/kg的剂量每日给药一次，起始剂量为2天（10/3 mg/kg d2）或病毒暴露后3天（10/3 mg/kg d3），或在病毒暴露后3天开始给予10 mg/kg剂量（10 mg/kgd3）。所有12只在病毒暴露3天开始给药GS-5734治疗的动物存活到实验终点。然而，在重复给药GS - 5734剂量10 mg/kg的动物中，抗病毒作用始终更强。第4天，与安慰剂组相比，GS-5734处理组血浆病毒RNA显著降低(P < 0.05)，几何平均值降低≥1.7 log10，并在第5天和第7天，当安慰剂组几何平均病毒RNA浓度超过10⁹拷贝/ml，在10 mg/kg d3组6只动物中的4只，病毒RNA检测水平低于定量下限(8×10⁴ RNA拷贝/ml)。对所有病毒RNA阳性的血浆样本进行的EBOV RdRp (L)基因的深度测序分析显示，没有证据表明基因型改变可能与GS-5734耐药EBOV变异的出现有关。

    综上所述，GS-5734是EBOV的有效选择性抑制剂。在健康的NHPs中，静脉注射GS-5734导致细胞内NTP水平的快速积累和维持。在致死性EVD的NHP模型中，尽管在第3天开始治疗(此时可以检测到系统病毒RNA)，但仍有显著的抗病毒作用、EVD症状改善和显著的生存获益。这些结果代表了在NHPs中第一例小分子抗病毒化合物对EVD的暴露后实质性保护。静脉注射的GS-5734目前正在对健康的人类志愿者进行多剂量研究，以评估临床安全性和药代动力学，并帮助确定GS-5734是否可能对EVD的急性或复发病例，或病毒持续性感染和/或慢性临床后遗症的幸存者提供治疗策略。GS-5734的广谱抗病毒活性及其对大规模生产的适应性，使我们有必要进一步评估其对其他人类病毒病原体的治疗潜力。

[1]Warren T K,Jordan R, Lo M K, et al. Therapeutic efficacy of the small molecule GS-5734against Ebola virus in rhesus monkeys[J]. Nature, 2016, 531(7594): 381-385.