【First-in-class药设系列】抗乙肝病毒的药物研发进展

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）的感染是常见的肝病致死因素。目前，疫苗，核苷和核苷酸类药物（Nucleoside or nucleotide drugs，NUCs）已经在减少乙肝新发感染和阳性患者长期抑制治疗方面取得一定成效。然而，这些药物在抗乙肝病毒的治愈方面仍存在不足，新的抗乙肝病毒药物和免疫疗法正在不断涌现，以期能彻底治愈乙肝病毒感染者。这里，我们将从HBV的生命周期出发，先回顾一下最近乙肝治愈性疗法的研究进展，介绍正在进行临床实验的化合物，并对这一领域存在的问题和挑战初步讨论。

    HBV会生成游离共价闭环DNA（Covalently closed circularDNA，cccDNA）并存在于受感染细胞核中，它是唯一已知的前基因组RNA（Pregenomic RNA，pgRNA）模板，也是转录病毒蛋白和病毒复制的模板。作为病毒维持的主要原因，cccDNA半衰期长，转录活性受到表观遗传调控，且在长期聚合酶抑制剂作用下仍能保持慢性感染。目前，还没有能够完全从受感染肝细胞中排除cccDNA的方法，这也是新抗病毒方法研究的一大挑战。HBV的免疫特征同样有利于该病毒的慢性化且难以消除。乙肝病毒的复制无法被胞内免疫系统发现，而肝内微环境的高耐受性及HBV大量产生抗原的特性会影响T细胞和B细胞的功能。血液中主要病毒抗原是乙肝e抗原（Hepatitis B e antigen，HBeAg），其他抗原包括乙肝核心抗原（Hepatitis B core antigen，HBcAg）和乙肝表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HBsAg）。其中HBsAg大部分用于设计无感染性的缺陷病毒颗粒。

    HBV慢性感染影响了超过2.5亿人，且每年因此死亡的人数约有65万，在中国这一情况更加严重。抗乙肝疗法主要通过最大限度抑制HBV复制来减少炎症反应，防止肝损伤和提高患者生存质量与时间。然而，除了Interferon- α (IFNα)，其他药物的药效都不可持续，包括NUCs在内都需要长期保持使用才能防止HBV复发。不仅具有病毒活性和肝炎临床特征（包括活跃的病毒复制和丙氨酸转移酶阳性）的患者需要HBV治疗，慢性乙肝（Chronic hepatitis B，CHB）患者也需要治疗。抗乙肝病毒治疗的整体目标是达到持续的血HBsAg降低，肝部炎症恢复，肝癌及肝硬化可能减少和肝炎复发降低，即所谓的功能性治愈。然而，目前的疗法仍不能有效达到功能性治愈，开发新疗法的目标就是要提升功能性治愈的概率。

乙型肝炎发生的自然病史

一、HBV的生命周期

    HBV组成上包含一个3.2kb的环状DNA基因组，编码大、中、小三种衣壳蛋白可分别作为L-，M-和S-HBsAg，并编码乙肝X蛋白（Hepatitis B X protein，HBx）等蛋白。病毒侵入始于L-HBsAg的pre-S1区结合肝细胞膜上的牛磺胆酸钠共转运多肽（Sodium–taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP），之后HBV脱衣壳并在细胞核内释放部分双链环状DNA。宿主的细胞DNA修复机器会将此DNA转换为cccDNA，并包装为病毒微染色体。作为转录模板，该微染色体可以长期作为病毒基因组库，并生成新的病毒感染其他细胞，也可以在子代细胞中存在。

HBV的生命周期和当前药物设计的靶点

HBx与cccDNA的染色体结构维持蛋白（Structural maintenance ofchromosomes protein， SMC）5和SMC6复合体作用，导致复合体被蛋白酶体解离，促进cccDNA转录，其中pgRNA在内的一系列病毒mRNA都可以促进转录。在病毒复制过程中，pgRNA可以先逆转录成负链DNA，再合成正链DNA，DNA合成结束后，成熟核衣壳可以回到核内保持cccDNA的数量，也可以与衣壳蛋白包装去感染别的细胞。研究人员曾发现，在血样中发现的病毒RNA可用于标记cccDNA的转录活性，反映化合物的效果；分离的RNA反转录产生的环状分离的DNA可在患者中发现，尤其是肝癌进展期的患者。

二、抗病毒药物

药物名称	研发公司	作用机理	所属分类	临床实验阶段
靶向进入的抑制剂
Myrcludex B (bulevirtide)	MYR医药	阻断NTCP	多肽	II
CRV431	Contravir	阻断NTCP和蛋白折叠	小分子	I
靶向转录的抑制剂
JNJ3989	Janssen	降解mRNA	siRNA	II
ARB-1467	Arbutus	降解mRNA	siRNA	II
GSK3389404	GlaxoSmithKline	降解mRNA	反义寡核苷酸	II
靶向衣壳装配的抑制剂
ABI-H0731	Assembly	结合核心	小分子	II
JNJ6379	Janssen	结合核心	小分子	II
JNJ0440	Janssen	结合核心	小分子	I
GLS4	HEC医药	结合核心	小分子	II
RO7049389	Roche	结合核心	小分子	II
AB-506	Arbutus	结合核心	小分子	I
靶向HBsAg分泌的抑制剂
REP2139和REP2165	Replicor	结合HBsAg	基于核酸的多聚物	II
免疫激活剂
Inarigivir	Springbank	RIG- I 激动剂和聚合酶抑制剂	小分子	II
RO7020531	Roche	TLR7激动剂	小分子	I
GS-9620	Gilead	TLR7	小分子	II
GS-9688	Gilead	TLR8	小分子	I
适应性免疫激活剂
TG-1050（T101）	Transgene/Talsy	疫苗	Ad5递送	I
HepTcell	Altimmune	疫苗	多肽加佐剂IC31	I

  1. 靶向HBV进入细胞的途径

    持续的病毒复制和释放造成了新的肝细胞被感染，从而维持了慢性感染和cccDNA库。在大部分患者中，NUC不能完全抑制病毒复制，所以进入抑制剂和复制抑制剂的联用是有前景的控制cccDNA的方式。进入抑制剂也可能对共用细胞入口的丁型肝炎病毒（Hepatitis Dvirus，HDV）有效。防止HBV进入细胞的抑制剂包括源于HBsAg的多肽，如Myrcludex B（又名Bulevirtide），它是一个从L-HBsAg开发的肉豆蔻酰化肽，单独使用48周可以造成2.84对数水平的HDV RNA下降，与IFNα共用效果更好。使用HBsAg作为标准判断时，2 mg Myrcludex B与IFNα共用使40％的患者出现响应，其中HBsAg下降的占26.7％。

    以依泽替米贝（Ezetimibe）和环孢菌素（Cyclosporin）衍生物为例，小分子化合物已在实验中证明可以防止病毒进入细胞，其中一些化合物已被验证可独立抑制NTCP受体。抗HBsAg表位的单克隆抗体也可以抑制进入，它们被证明能够加速循环中HBV的清除。同时，抗体可能有额外的抗病毒活性，因为它们能够干扰血清HBsAg和感染性病毒分泌物的生成。除了从头阻断感染，之后也会讨论抑制感染性病毒复制的策略。

2. 靶向cccDNA

    虽然抑制cccDNA形成本身的机制很有吸引力，但在此策略可以成药之前必须更加完全地了解其形成过程。目前，已知cccDNA形成需要宿主核酶，例如TDP2,FEN1和POLK等，病毒微染色体形成需要核组蛋白和其他染色体成分。因此，靶向宿主细胞的疗法可能有一定副作用，我们也需要进一步研究病毒特有的相互作用来促进疗法研究。一旦cccDNA形成，其可能被锌指核酶或者转录激活因子样效应物核酶进行靶向。当前，使用CRISPER/Cas9技术利用RNA结合靶DNA是一个潜在有效抑制cccDNA的策略，临床前实验显示此策略能够引发cccDNA的突变和删除，进而导致其失活。然而，还有7%的切割后的基因组能够修复，因此完全灭活cccDNA可能需要多种不同的单靶向RNA。在这些技术应用之前，需要考虑肝脏递送，脱靶效应，切割已整合进染色体的HBV-DNA以及意料之外的染色体DNA重组等问题。

3. 靶向病毒基因的表达过程

    考虑到在慢性肝炎中起到重要作用的高抗原负载，通过沉默cccDNA转录和降解病毒RNA，从而直接降低病毒基因表达的抗原和调节蛋白不失为一条抗HBV思路。在控制转录方面，使用通用表观遗传调节剂改变cccDNA的表观遗传特征可能会破坏体内细胞的平衡，所以该策略主要关注涉及到cccDNA转录活性调节的病毒特异性因子，例如靶向HBx或者核心蛋白。近期发现HBx通过控制DNA损伤结合蛋白1（DNAdamage binding protein 1，DDB1），包括E3泛素连接酶来解离SMC5/6。因此可以通过靶向HBx和DDB1的相互作用抑制病毒。在肝细胞中，一种NEDD8激活酶抑制剂Pevonedistat可以恢复SMC5/6水平并抑制病毒转录复制。另外，已受到FDA批准的肠炎抗感染药物Nitazoxanide也可以在细胞水平抑制HBx-DDB1相互作用，恢复SMC5水平并抑制病毒转录复制。

    核心蛋白的C端精氨酸可以和cccDNA相互作用并调节阻挡乙酰化水平，进而影响转录。IFNα能够抑制转录的原因可能是组蛋白去乙酰化酶1在IFNα作用下被招募到了cccDNA上，并降低了H3的K27和K122乙酰化水平。然而，IFNα介导的病毒RNA下降与抑制转录的翻译后修饰似乎并无关联，IFNα和HBx的关系也并不清楚。另外，能够抑制组氨酸乙酰转移酶CBP和p300的小分子选择性抑制剂C646已在细胞水平表现出抑制HBV转录的效果。类似地，最近出现的前药GS-5801通过阻断赖氨酸去甲基酶5抑制转录，造成全局H3K4的甲基化，且恢复缓慢，效果可达10天以上。然而目前的研究还缺乏对cccDNA的选择性。

    在翻译后修饰方面主要采用基于核酸的策略，包括RNA干扰，反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASOs）和核糖核酸酶。其中靶向病毒mRNA被认为是治愈乙肝的重要组成部分，因为它可以通过抑制cccDNA和整合DNA两方面来减少HBsAg表达，进而恢复免疫功能。另外，通过精心选择重叠度高的序列，多个mRNA片段可以被同时靶向。

    在RNA干扰疗法ARC-520的研究中，小干扰RNA（smallinterfering RNA，siRNA）显示出了治愈HBV的潜力。CHB患者对ARC-520的不同响应水平说明可能还有cccDNA之外的HBV模板来源，例如整合的HBV DNA。在大猩猩模型中观察到了删去整合序列的3’端在不同HBeAg水平中造成的不同响应，而在使用二代siRNA删除上游基因时，没有观察到这种区别。尽管这些研究表面整合DNA可能参与HBsAg表达，是否需要阻断整合序列的转录翻译来达到治愈还有待商榷。

    小分子在抑制病毒RNA方面也有所建树，如RG7834就是新型口服小分子HBV基因表达抑制剂，其选择性在细胞和人源小鼠上都经过了评估。结果显示，RG3784明显降低了病毒蛋白表达和病毒血症，联用RG3784，恩替卡韦和聚乙二醇IFNα在人源小鼠中也成功降低了病毒DNA和HBsAg水平。分子实验显示它可以在病毒RNA形成pgRNA之前将其降解。这类化合物的临床表现可以拭目以待。同时，该类化合物能否降低亚基因组转录，比如cccDNA 和整合病毒基因组的转录也值得期待。

4. 靶向衣壳装配的过程

    衣壳装配抑制剂和NUC的联用和减少病毒水平到NUC无法作用的程度也许能够提升CHB患者的特异性免疫响应这一设想有关。根据抑制剂作用下形成的衣壳的形态特征，这些化合物可分为两类：以杂芳基二氢嘧啶为代表的核心蛋白变构调节剂（Core protein allosteric modulators，CpAM），例如GLS4和RO7049389，它们会导致非衣壳核心聚合物组装错误；以苯丙酰胺或氨磺酰基苯甲酰胺为代表的衣壳装配调节剂，例如AT-130，NVR-3778，JNJ6379，JNJ0440，AB-423和ABI-H0731，它们会造成病毒核酸衣壳形态异常。二者都可以减少感染性病毒颗粒释放，抑制核衣壳转运到细胞核以及cccDNA的形成。同时也可能通过干扰核衣壳解离，进而影响cccDNA的从头合成。此外，CpAM还能够影响核心蛋白在cccDNA结合与转录中的作用。

5. 靶向HBsAg的释放过程

    抗病毒聚合物属于一类广谱病毒附着或进入抑制剂，其活性随聚合物长度和疏水性的增加而增加。这类化合物的最新成员是核酸聚合物，其活性源自硫代磷酸化寡核苷酸作为两亲性聚合物的特性。它们可以在HBV感染中抑制HBsAg释放，近期，和IFNα联用的聚合物REP2139控制了HBV和HDV的联合感染，降低了转氨酶，也表现出明显的HBsAg下降。进一步的临床实验前需要清除它的作用机理，并严格监管，当然也可能提供新的生物标记物，患者分型和药物联用方式。

    总之，针对cccDNA和HBsAg形成的新抗病毒策略是在治愈HBV方面迫在眉睫，目前基本也正在临床前模型或早期临床试验中进行评估。cccDNA方面，总目的是抑制cccDNA的转录产物，从而间接影响肝cccDNA库，或直接根除或沉默cccDNA。对于HBsAg，将需要考虑其从cccDNA和整合的HBV DNA的两种产生方式。也不排除以上两种方法的联用，甚至可能还需要免疫刺激方法与抗病毒药物协同作用。此外，治愈HBV是否需要从受感染的肝细胞中清除病毒，杀死受感染的细胞，还是既要清除病毒，又要杀死细胞尚不明确。

靶向固有免疫和适应性免疫的抗病毒策略

三、免疫疗法

    正确激活抗病毒免疫也能治愈HBV。HBV受到控制的患者都有协调的抗HBV体液免疫和细胞免疫，包括靶向病毒抗原的强T细胞响应和分泌病毒抗体的B细胞响应。在骨髓移植具有HBV特异性记忆的B和T细胞后，CHB患者HBsAg可以转阴性，这证明了免疫疗法的效果和治疗慢性感染的潜力。HBV的另一个免疫特征是它可以逃避固有免疫识别，大部分研究证明其在肝细胞和系统中都可以逃避识别、但激发固有免疫可以抑制HBV复制。其他肝炎病毒的共感染也可以激活固有免疫而抑制HBV。可用的途径包括胞内的维甲酸诱导基因I蛋白（Retinoic acid- inducible gene I protein，RIG- I）通路和APOBEC通路，以及IFNα等细胞因子。因此，激活这些固有免疫途径已被认为是可能的HBV免疫疗法。自然杀伤（Natural killer，NK）细胞在HBV免疫抑制中的作用还未确定，IFNα可能通过激活NK细胞抑制HBV复制，但还不明确NK细胞直接靶向受感染细胞还是调节HBV特异性的T细胞。

1. 靶向固有免疫的策略

    靶向固有免疫的策略包括直接使用有抗病毒效应的细胞因子（TNF，IFNα，IFNγ以及IL-1β）或者介导适应性免疫。IFNα疗法在5-10%的CHB患者中有效，能够造成真正的功能性治愈。机理包括其直接抗病毒效应和对NK细胞的诱导。HBsAg阴性患者还能恢复HBV特异性的T细胞响应。

    使用抗病毒细胞因子的疗法不止能抑制HBV复制，还能排除cccDNA，这也是最直接有效的CHB患者治愈策略。体外实验观察到了细胞因子疗法介导的APOBEC依赖的病毒DNA脱氨，进而消除cccDNA，引发了能否在不杀死肝细胞的情况下降低其cccDNA水平的思考。同时，此效果是否具有cccDNA特异性和该实验的临床相关度还有待研究，尤其在临床使用IFNα没有观察到cccDNA消除的情况下。

    使用Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）或者RIG-I激动剂也可以激活固有免疫。包括使用RIG-I激动剂直接激活肝细胞免疫，或者口服TLR7/8激动剂激活附近免疫细胞。以依那吉韦为例，RIG-I激动剂也有抗病毒效应，但是主要通过激活胞内IFN通路起效。在人体实验中，依那吉韦造成了HBV DNA0.58-1.54的对数下降，尤其起效于HBeAg阴性患者。同时HBsAg也有下降。作为TLR7激动剂，GS-9620介导了浆细胞样树突状细胞的IFNα生成，在动物实验中表现出了一定抗病毒活性，但在低剂量人体实验情况下表现不佳，不过观察到了ISG15的剂量依赖性上升以及NK和T细胞的增加。TLR8激动剂能够激活胞间细胞因子生成，尤其是IL-12和IL-18，进而介导胞间NK和NK T细胞，尤其是肝内较多的粘膜相关性恒定T细胞的IFNγ合成。由于IL-12对HBV特异性T细胞的恢复，TLR8激动剂也可能通过T细胞杀伤HBV。

2. 靶向适应性免疫的策略

    CHB患者的HBV特异性免疫是有缺陷的，检查点抑制剂或者疫苗可能能够加强这种免疫。阻断PD1-PDL1相互作用能够部分恢复特异性T和B细胞响应。抗PD1疗法效果有限，但是在CHB患者中观察到了持续的抗病毒活性，不过患者寻找和疗法最佳剂量还有待确定。

    疫苗方面，已经针对CHB患者开启了一些疫苗实验，然而经典预防性疫苗效果不佳，新型疫苗在抗病毒药物联用与否中都效果有限，目前只在土拨鼠模型中观察到和抗PD1抗体共用的有效疫苗。

    除此之外，还可以通过编辑HBV特异性的T细胞来解决问题，可以在T细胞上编辑包含抗HBsAg特异性抗体的或者经典的HBV特异性T细胞受体（T cell receptors，TCR）的抗原受体，编辑后的T细胞可以很好地识别HBV感染细胞。也有人设计了只有有限细胞功能但是抗病毒能力较强的HBV特异性T细胞，然而，这种细胞的难以培养影响了这项技术的使用。因此，使用TCR状抗体或者可溶性TCR帮助内源性T细胞定位感染细胞也不失为一种选择。这种方法不需要体外的T细胞培养。该策略已经在HIV感染中应用，且在HBV中也成功递送了细胞因子。在动物模型中，经典的抗HBV保护性抗体也被证明有效。

3. 影响免疫疗法的变量

    CHB患者的肝内环境可能影响了免疫疗法的进行，因为体外实验并没有慢性炎症环境。例如，胞间的高细胞因子信号传导抑制因子3（suppressor of cytokine signaling-3，SOCS3）就可能导致了IFNα的低效。患者中炎性浸润的出现也会抑制特异性的T细胞响应，例如炎性浸润中的TNF就会直接抑制T细胞，同样，调节免疫细胞在CHB患者中的富集也会下调免疫响应。另外，死亡肝细胞释放的精氨酸酶会破坏特异性T细胞工作必须的精氨酸。最后，CHB患者的慢性肝炎和肝纤维化会造成免疫细胞从肝窦渗透，降低浓度。

    HBV产生的大量抗原也会影响宿主的免疫机能，比如说损害髓样细胞和浆细胞样树突状细胞功能，干扰TLR介导的细胞因子或者抑制抗原呈递。但是也有数据表面HBV感染能够整体激活机体免疫力。B细胞方面，HBsAg的持续存在会改变HBsAg特异性B细胞的功能，包括产生缺陷抗体，非典型记忆表型和上调抑制性受体。总体上，受感染肝细胞会逐渐耗竭特异性T和B细胞，而不是抑制整体的免疫。

    因此，免疫疗法需要因人而异地使用，在早期感染，肝结构正常，没有免疫抑制因子和HBV特异性T细胞库丰富时效果较好。同时也要考虑安全问题。另外，与NUC的联用可能是有前景的，因为NUC除了抑制病毒，还可以减少肝内炎症，促进免疫细胞。

四、未来展望

   针对困扰药物研发多年的治愈HBV这一难题，越来越多的共识是可能需要联合使用病毒靶向药和免疫系统激动剂，才能实现功能性治愈。既控制新感染，又根除感染细胞则需要实现以下目标：完全抑制病毒的产生和从头感染；完全抑制HBsAg的产生（来自cccDNA和整合的病毒序列）；适当增强免疫系统以增加HBV特异性反应并安全地维持肝脏的免疫反应。在前临床阶段，动物模型在某种程度上限制了可测试的药物组合的多样性，而在临床上，在单个公司产品组合中对处于类似发展阶段的药物的测试需求也限制了这一多样性。

近期的一篇文章总结了在HBV感染中进行联合研究的基本原理，并提出了一系列建议：需要提供扎实的科学依据；了解临床前开发过程中任何潜在的交叉毒性；审查临床副作用并特别评估潜在的交叉毒性问题，评估潜在的药物相互作用，应对预期的转氨酶水平升高和任何潜在的肝毒性问题，并在没有晚期肝病（如肝硬化）的患者上开展初步研究。

    总而言之，针对HBV的新治疗策略旨在实现功能性感染的治疗，其特征是持续的治疗可以获得HBsAg的不断下降。研究抗病毒方法的关键挑战在于cccDNA和整合的DNA的存在，以及HBV特异性免疫的复杂调节。在任何新方法中都需要解决病毒抗原的普遍性，以及由慢性感染引起的特定肝脏微环境的改变。新的数据和思路要求诱导HBV特异性免疫反应，这可能需要结合新的抗病毒和免疫增强疗法，也许还要重新评估需治疗的患者人群。

参考文献

1. Fanning GC, Zoulim F, Hou J, Bertoletti A.Therapeutic strategies for hepatitis B virus infection: towards a cure. Nat RevDrug Discov. 2019, 18(11): 827–844. 

2. Nassal, M. HBV cccDNA: viral persistence reservoir and key obstacle for a cure of chronic hepatitis B. Gut 2015, 64: 1972–1984.

3. Terrault, N. A. et al. Update on prevention, diagnosis, and treatment of chronic hepatitis B: AASLD 2018 hepatitis B guidance. Hepatology 2018, 24: 1560–1599.