【First-in-class药设系列】罕见病药物的研发进展和挑战
尽管罕见病（Rare diseases）的分子机理研究在立法和经济支持下有所推进，大部分罕见病目前依旧缺乏获批的治疗方法。为跨越这一转化医学上的鸿沟，选用最佳的治疗形式来将罕见病知识转化为孤儿药尤为重要。当前罕见病主要药物研发形式包括小分子（Small molecules），单克隆抗体（Monoclonal antibodies），蛋白替代（Protein replacement therapies），寡核苷酸（oligonucleotides，ASO），基因及细胞疗（Gene & cell therapies），以及药物再发现（Drug repurposing）等。为了更好了解罕见病的药物研发进展，我们将展开讨论这些罕见病疗法的优缺点，以促进相关的成果转化。
一、小分子类药物
由于给药形式的多样，可控的剂量，高稳定性，合成规模大以及消耗低，小分子是罕见病药物研发中建立最完善的技术。罕见病的小分子药物的发现主要来源于对模式细胞系的大规模筛选。在筛选后，研究者们可以根据具有活性的化合物进行同系物优化来提高体内外疗效，并优化小分子的吸收，分布，代谢，排出和毒性（ADMET）特性，以最终获得在临床上更好效应的上市药物。
筛选体系上效应和人体结果的往往不同，阻碍了罕见病从基础到转化的效率。近期，在小分子筛选体系中引入诱导多能干（Induced pluripotent stem，iPS）细胞，基因编辑技术（CRISPR-Cas systems）和类器官（Organoids）等方法有效提升了筛选通量及其效率。iPS细胞可以从活检样本分化成异常的细胞，其应用于脊髓性肌萎缩疾病筛选中发现进而优化获得进入临床II期的LMI70候选化合物，该小分子可以结合生存运动神经元蛋白2（survival motor neuron protein 2，SMN2）的 pre-mRNA/细胞剪接机器复合体来增强SMN2的分泌。利用基因编辑和测序技术通过向动物模型中导入人源突变，也是进一步加速筛选效率的重要突破。例如，在囊性纤维化中，治疗性分子Ivacaftor从对已知CFTR基因（Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein）突变的细胞系体外筛选中获得，它可以治疗多种突变型，修复突变造成的蛋白破坏效应。另外，Lumacaftor在筛选中也被发现能够促进CFTR的调控，修正蛋白错误折叠，可以与Ivacaftor在最常见突变CFTR F508del中联用，在临床实验中一定程度上发现有效结果。类器官由于对组织和功能的模仿也使它成为了小分子筛选的有效模型，可以在酵母、线虫、果蝇和斑马鱼等模式生物中实现了良好的小分子药物筛选平台，且同时可以进行对机体毒性和细胞吸收方面的研究；例如，Ivacaftor和Lumacaftor在类器官中也证明了联用可以调控CFTR功能的恢复。
利用上述新颖的筛选体系，作用机制新颖的小分子药物不断涌现。在溶酶体贮积症（Lysosomal storage disorder，LSD）中，FDA批准了靶向所有组织抑制失能酶底物合成的小分子药物（Miglustat和Eliglustat），其中Miglustat还可以作为分子伴侣稳定及修复突变的酶，其他药物也在临床实验中。促进终止密码子通读的小分子在特定基因突变造成的罕见病中也有一定前景。如杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）患者就有肌营养不良蛋白的终止密码子突变，小分子Ataluren能够在小鼠模型中促进终止密码子通读，已在欧盟被批准。小分子药物也能用来提升特定蛋白水平。如促进肌营养相关蛋白表达在动物模型中也可以减缓DMD，尽管相关小分子还未成功进入临床实验。另外，针对LSD的小分子蛋白变构调节剂可以提升细胞压力响应，并上调分子伴侣热休克蛋白70以促进蛋白折叠，其进展也在最近被披露。
在罕见病治疗方面，小分子药物优点明显，如靶向广泛，易于生产，且相比其他方法，之前的经验也有利于新分子的研究，对于机理不明或者多因素疾病，表型筛选也会对发现有效小分子起到正面作用。另一方面，找到同时具备好的药理学效应和药代动力学效应同时又脱靶效应低的小分子是很艰难的，需要经历复杂的优化过程。当然，一些已被证明安全的其他药物可以应用于罕见病，随着对罕见病机理研究的深入，类似于抗癌靶向不同病因的联合疗法也将成为可能。
二、抗体药物
自从首个单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）muronomab-CD3在1986年被批准治疗移植后排异反应（Organ allograft rejection）开始，抗体相关疗法在癌症和免疫异常等多种疾病中得以发展。抗体主要通过调节信号传导途径，将细胞或蛋白质募集到特定位点，传递细胞毒素或中和及调节循环因子来发挥作用。mAb由B细胞产生，在免疫过程中识别外来抗原，其关键点在于对抗原的特异性和该特异性的持续性。针对最初疗法中鼠源抗体半衰期短的问题，研究人员设计了人-鼠混合抗体，人源化鼠抗体或者人抗体来提高mAb疗法。同时，抗体工程的进步也使得全长naked mAb和工程化抗原结合片段（antigen- binding fragments，Fab）成为可能，它们可以提高限定区域（比如眼底）的药物浓度，降低全局生物活性并降低毒性；还可以生产双特异性抗体（bispecific antibody，BsAb），相比mAb，BsAb具有直接引导免疫系统击毁靶细胞或者同时阻碍两个不同靶点的能力，当前已有两种BsAb上市。
临床应用方面，mAb在罕见病上的应用目前还有限，不过该类药物的潜力正在被发现。例如，靶向末端补体蛋白C5的mAb——Eculizumab是第一个在十年前获批治疗阵发性夜间血红蛋白尿的单抗，它也被批准治疗两种补体体系发挥重要作用的罕见病：非典型溶血性尿毒症综合征和重症肌无力。此外，靶向免疫因子IL-1β的Canakinumab单抗被重新发现并在2009年批准用于冷冻蛋白相关的周期性综合征，在其他IL-1β相关的罕见病中也可能应用。同样靶向IL-1β的rilonacept是一种融合蛋白，由人IL-1受体的胞外配体结合域和与人IgG1的Fc部分连接的IL-1受体辅助蛋白组成，在2008年也被批准治疗冷冻蛋白相关的周期性综合征。在BsAb方面，迄今为止两种获批，其一是针对血友病的，Emicizumab的机理是与IX因子和X因子结合，使这些蛋白彼此靠近并启动凝血级联反应。针对von Willebrand因子的纳米抗体Caplacizumab，最近已在欧盟和美国获批用于获得性血栓性血小板减少性紫癜的治疗。
除了单纯抗体类药物，使用抗体恒定区（antibody constant region，Fc）融合非抗体相关蛋白或者使用全长抗体融合其他小分子发展了抗体-药物结合物（antibody–drug conjugate，ADC），Fc融合蛋白有IgG的优点，可以结合新生Fc受体促进体内稳定性和疗效。ADC则可以利用抗体的特异性将细胞毒性药物直接递送到肿瘤表面，减少对健康组织的损伤。像BsAb一样，其潜力还在被研究，只有一些血液癌的ADC目前被批准，不过也有超过50种ADC活跃在临床实验。
抗体在治疗方面的优点主要在它相对于小分子药物的特异性，限制了脱靶毒性，这对罕见病长期药物递送很重要。它的另一个优点在于它的体内很稳定，可以降低给药频率。对于获能突变引发的罕见病，抗体疗法建立较好。当然，抗体的缺陷也很明显，mAb的大体积限制了它们的组织和细胞渗透，从而影响了对某些理论上理想的靶标（如细胞内蛋白质）的结合；由于抗体生产一般需要大量哺乳动物细胞和复杂纯化步骤，mAbs的生产成本也可能高得惊人；此外，mAb需要注射给药，因此在配制阶段需要非常高的无菌标准，并且可能会引发注射部位的不良反应。
三、蛋白替代疗法
与mAb适合获能突变罕见病不同，蛋白替代疗法是为失能突变相关的罕见病所设计的。较为成功的方向是使用外源补充的酶（Enzyme replacement therapy，ERT）来替代缺失或者功能缺陷的酶进行治疗。该概念起源于1960年对LSD的治疗，首个疗法在1987年被批准，该疗法使用人α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，A1AT）治疗与严重A1AT缺乏症有关的肺气肿。目前ERT的研究主要靶向溶酶体酶相关的LSD，在1980年代，NIH的布雷迪及其同事证明从胎盘中纯化的葡糖脑苷脂酶可用于治疗戈谢病，为ERT治疗LSD奠定了基础。纯化的人胎盘葡萄糖脑苷脂酶由Genzyme进一步开发，并于1991年首次被FDA批准为商业ERT。出于安全和供应原因，Genzyme开发了一种葡萄糖脑苷脂酶的重组形式，该形式于1994年由FDA首次批准。ERT的酶通常来源于天然蛋白或者高度同源重组蛋白，前者由于HIV和供应不足不太可取，因此大部分来源于重组蛋白，它允许修饰来保持稳定性、提高活性或者促进靶向性。由于原核生物体系不能产生所需的翻译后修饰，目前生产ERT的酶主要使用中国仓鼠卵巢细胞或者修饰的人类细胞。
临床方面，目前世界范围内已经批准上市了11种ERT，可以治疗高雪氏病，法布里氏病，Hurler-Scheie病（也称为I型粘多糖贮积病（mucopolysaccharidosis type I，MPS I）），Hunter病（MPS II），庞贝病，马洛特-拉米病（MPS VI），溶酶体酸性脂肪酶缺乏症（Wolman病） ，巴滕病（2型神经类脂褐质疏松症），莫尔基奥综合症（MPS IVA），斯莱病（MPS VII）和α-甘露糖苷病。正在开发靶向Sanfilippo A综合征（MPS IIIA）和Sanfilippo B综合征（MPS IIIB）的ERT。一些天然ERT也被用于A1AT增强和与腺苷脱氨酶缺乏症相关的严重联合免疫缺陷病，重组ERT还被批准用于低磷血症和苯丙酮尿症。
蛋白替代疗法优点和缺点同样限制：（1）如果递送位置和递送量正确，且早于不可逆损伤发生前递送，效果很好，但其在器官不可逆损伤的患者中可能失效。在高雪氏病中，酶表面的甘露糖也能够帮助酶进入巨噬细胞，但如其他非高雪氏病的LSD中，需要酶的细胞可能缺乏甘露糖受体，不易使酶进入，同时可能需要更高的酶摄入量，另外酶难以穿过血脑屏障；（2）ERT疗法十分安全，只有少数有不良反应，然而过敏等不良反应不仅会造成机体损伤，也可能影响酶的效果；（3）ERT的技术建立较好，但也有制造纯化过程复杂，新产品难以生产等问题。
四、寡核苷酸疗法
另一个靶向致病基因的方法是干扰RNA水平，其中最常用的是ASO和siRNA，它们都能够促进mRNA降解并降低基因表达。比起抗体，它们不仅具有靶向性，同时也能靶向任何基因，而不只是细胞表面或者循环系统的蛋白。ASO和siRNA的挑战主要来源于递送，但近期的临床实验说明了它们的潜力。
ASO是可通过碱基配对结合靶标RNA的合成核酸序列，能够影响基因表达。首个疗法在70年代末期开始实验，ASO结合mRNA并造成其被核酸酶H选择性降解，以敲除相关蛋白。siRNA是双链干扰RNA，可通过修饰骨架以增强其可药性。针对递送问题，研究者们发展了脂质纳米颗粒或N-乙酰半乳糖胺在内的多种方法。此外，单链RNA阻断剂也可能用于罕见病治疗，且能够恢复基因功能，而不是只像ASO和siRNA一样起到抑制作用。
临床方面，首个ASO——fomivirsen曾于1988年被批准用于治疗免疫受损患者的巨细胞病毒性视网膜炎（目前已被召回）。在罕见神经系统疾病中ASO前景较好，如治疗遗传性甲状腺素（hereditary transthyretin，TTR）介导的淀粉样变性的siRNA Patisiran和ASO inotersen，二者都降解编码TTR的mRNA，降低TTR水平。另外，Nusinersen已获批治疗由染色体臂5q突变引起的脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）。它通过促进存活运动神经元蛋白（survival motor neuronprotein，SMN）2的mRNA转录，生成全长SMN起作用。Eteplirsen则可以结合肌营养不良蛋白前体mRNA的第51外显子，略过其剪接，从而纠正翻译阅读框，并使DMD患者的肌营养不良蛋白缩短但保持功能。然而，Eteplirsen的效果一直存在争议。
优缺点方面，寡核苷酸疗法的机制特决定了它的高特异性，同时全身暴露有限，因此毒性较弱。这大大扩展了可选靶标的数量和类型。由于大多数已知的罕见疾病是遗传的，寡核苷酸疗法靶向RNA提供了控制发病率和死亡率的可能。但是，寡核苷酸不易穿越血脑屏障，因此需要侵入性递送方法这阻碍了其在中枢神经系统疾病中的临床应用。尽管如此，最近获批的大量药物可能会促进罕见病相关ASO的研发。例如，一种靶向亨廷顿蛋白（huntingtin，HTT）mRNA的ASO，即RG6042，最近已进入亨廷顿病III期临床试验，这可能成为该神经退行性疾病的首个改良疗法。
五、基因和细胞疗法
基因治疗可在罕见病中用于表达所需蛋白质，进而弥补特定蛋白质功能丧失；另外还能引入干扰RNA的基因，以抑制致病基因的影响。方法上，基因疗法可以直接注射到靶标组织或器官中，也可以在体外修饰细胞以产生治疗因子，之后移植回患者体内。后者对于罕见的遗传性血液疾病特别有用，比如可以收集患者造血干细胞（Haematopoietic stem cells，HSC），进行基因改造后再移植回患者。针对罕见病的其他类型的细胞疗法也正在开发中。
腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）载体和逆转录病毒/慢病毒载体是最常用的基因疗法平台。重组AAV载体可以插入小于5000个碱基以进行基因治疗。十三种不同的AAV血清型可以使其靶向不同器官，组织和细胞类型。例如，AAV-8已在三项临床试验中将治疗基因传递至肝脏，而AAV-9已在四项神经疾病中进行了试验。基于衣壳蛋白晶体结构，现在也可能工程化新衣壳以开发针对特定细胞和组织的载体。另外，治疗用的AAV不会将基因整合进人体细胞，这保证了安全性，也使其会在细胞复制中丢失信息，因此只能用于非分裂（或非常缓慢分裂）细胞类型的基因治疗。AAV载体十分安全，其在200多次人类临床试验中，没有造成任何死亡或致癌。由AAV载体引起的最常见的严重不良反应是肝脏转氨酶水平的短暂升高，这提示有肝损害，与对AAV衣壳蛋白的免疫反应有关，但通常可以通过类固醇来控制。逆转录病毒包含单链RNA基因组，并具有通过逆转录将基因整合到人类基因组中的能力，这会造成基因组的永久修饰。慢病毒是逆转录病毒家族的一个属。逆转录病毒主要用于研究血细胞疾病。使用γ逆转录病毒可以在腺苷脱氨酶（adenosine deaminase，ADA）缺乏症相关的严重合并免疫缺陷病（severe combinedimmunodeficiency disease，SCID）中显示出明显疗效，从而使患者能够停止ERT。但是，在X连锁的SCID和Wiscott-Aldrich综合征以及X连锁的慢性肉芽肿病的试验中，γ逆转录病毒载体的患者可能会出现基因整合导致的白血病。由于慢病毒载体感染效率更高且可以自我灭活，因此慢病毒载体的应用在逆转录病毒方面逐渐广泛。
细胞疗法根据最初的细胞来源，可分为患者特异性的来源或者制备好的细胞来源这两种。可用的细胞包括T细胞，树突状细胞，HSC，间充质基质细胞，CD34选择的细胞，胰岛细胞，成纤维细胞，自然杀伤细胞，神经干细胞，胚胎干细胞和iPS细胞。通过包括靶细胞分离，培养，洗涤，体积减少和其他配方的某种组合的过程进一步修饰源细胞，之后可以选择冷冻保存。iPS细胞具有分化为许多可以针对多种疾病适应症的不同细胞类型的能力，因此引起了人们的极大兴趣。如上所述，离体修饰通常是通过使用病毒载体实现的。也有额外的体外修饰方法在进行研究，例如锌指核酸酶和基于CRISPR–Cas9的方法。与体内基因组编辑相比，体外编辑的脱靶风险将大大降低。以镰状细胞疾病和地中海贫血的潜在治疗方法的开发为例，二者是由β-珠蛋白基因的突变影响血红蛋白的合成所致。目前正在研究再输注离体基因编辑后的pre-HSC效果。另外，CRISPR诱导的γ-珠蛋白基因的阻遏物BCL11A的破坏，可以造成代偿性的胎儿血红蛋白表达。
临床应用方面，基于AAV的疗法在SMA，A型和B型血友病，芳香族l-氨基酸脱羧酶缺乏症和视网膜色素上皮特异性65-kDa（retinal pigment epithelium-specific65-kDa protein，RPE65）蛋白介导的视网膜变性中已被证明有效。至今，三种基于AAV的基因疗法已被批准治疗罕见病。Alipogene tiparvovec是一种AAV-1载体，可表达脂蛋白脂肪酶基因。它是首个引入主要市场的基因疗法，并于2013年获批用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症，但由于商业原因在2017年被撤回。最近，表达RPE65基因的AAV-2载体voretigene neparvovec在2017年获批治疗RPE65突变相关的遗传性视网膜营养不良。在2019年，onasemnogene abeparvovec，一种表达编码SMN1的AAV-9载体，已获批治疗SMA。Strimvelis是一种表达ADA的逆转录病毒，在2016年获批治疗与ADA缺乏相关的SCID，也是第一种被批准用于罕见疾病的离体基因疗法。慢病毒平台已成功治疗三种神经系统疾病：X连锁性肾上腺皮质营养不良，变色肾上腺皮质营养不良和脑肾上腺皮质营养不良。另外，CART细胞疗法不仅在癌症中应用，也在2019年6月获批基于编码βA-T87Q-globin基因的自体CD34 +细胞，进行β地中海贫血治疗。
优缺点方面，AAV载体表现出治疗单基因罕见病方面的临床优越性，它已对多种疾病具有临床疗效，相关研究表明，AAV载体可在非分裂细胞中持续多年地表达基因。但是相比小分子，该疗法所需分子的制造和生产极为复杂。其他局限性包括免疫反应引起的AAV转导细胞丢失，载体血清型缺乏以及基因组有限。AAV也可通过递送基因组编辑酶以治疗罕见疾病。然而，基因组编辑完成后相关基因的长期表达可能会带来负面影响。逆转录病毒已被证明可以有效对血液疾病进行离体基因治疗，致癌作用这一问题可被自灭活慢病毒载体解决。另外，由于存在毒性，输注基因修饰的HSC前需要进行清髓处理。此外，细胞疗法难以确保一致性也提高了使用成本。因此，需要进一步的联合研究以解决这些挑战。总体而言，与小分子，抗体和蛋白质替代疗法相比，基因和细胞疗法作为平台尚处于发展的早期阶段，然而，这种疗法可能一次性治疗甚至是治愈疾病，因此对罕见病具有深远的意义。
六、药物再发现
药物再发现指的是评估已批准或正在研究的药物，以治疗与先前批准或临床研究的产品不同的疾病。多数再发现的化合物已在人体中证明了安全性，有些已进入II期或III期试验。因此，从理论上讲，可以在不同适应症中对此类分子进行临床测试，从而为再发现的药物提供比全新药物更快，风险更小，成本更低的途径。
从历史上看，药物再发现通常来源于偶然临床观察，同情用药和违规处方。目前的方法大致分为实验方法和计算方法。实验方法包括分子图谱分析，目的是鉴定批准药物和临床试验候选药物的其他与罕见病相关的靶标；以及此类化合物文库的表型筛选，目的是加快将命中资料转化为临床试验。计算方法包括虚拟筛选和基于相似性的方法，还包括对临床试验数据，病历和/或上市后监视数据的回顾性分析，旨在识别可与其他疾病相关的意外信号。例如，转化生物信息学可以部署与机器学习相结合的网络和系统生物学方法，以推断生物分子与临床观察结果之间的未发现关系，从而推测蛋白质在疾病中新功能和新作用。
临床应用方面，药物再发现通常是成功的，比如sildenafil和adalimumab，它们来源于批准常见病治疗后的罕见病批准。sildenafil是一种小分子磷酸二酯酶5抑制剂，为心绞痛而开发，1998年被批准用于勃起功能障碍。根据其对血管的影响，随后也将其于2005年批准用于罕见疾病肺动脉高压。adalimumab是一种针对关键性炎性细胞因子肿瘤坏死因子的mAb，并于2002年首次被批准用于类风湿关节炎。此后，它还获得了其他几种炎症性疾病的进一步批准，其中一些罕见病包括多关节性幼年特发性关节炎和非感染性中、后葡萄膜炎和胰腺炎。药物再发现也受到了政府组织、药企和非营利组织的关注。
优缺点方面，药物和靶标的再发现创造了对已有药物转化研究的潜力。但并未消除药物开发中的所有潜在挑战。首先，尽管安全性数据较易获得，也有一定程度对临床效益的了解，这降低了开发成本并提升了成功机会，但仍需要进行临床试验以证明新适应症的有效性，且可能需要大量投资。其次，尽管针对原始适应症的安全性数据也许可用，但是在有新适应症（例如合并症）或治疗方案不同的情况下，药物的安全性可能变化。因此，应仔细评估新适应症中改用药物/靶标的临床安全性。第三，知识产权问题可能会延迟用于临床评估的化合物的获得，并降低公司投资的动力。为了解决这些问题，需要更多的合作以及临床数据的共享。
未来展望
罕见病和相关疾病的数量表明，这种疾病组应在公共卫生加以更多考虑，而不是按单个疾病考虑。尽管已经采取了各种举措，但罕见病领域的所有利益相关者都需要合作来弥合罕见病领域的基础研究与疗法开发之间的巨大差距。如今，对罕见病的高质量研究的很大一部分在没有到达临床的情况下就结束了，甚至在临床前阶段就结束了。尽管获批孤儿药的数量在稳步增长，但批准的孤儿药只占一小部分罕见病，且只有5％的人接受了批准的疗法。在某些疾病领域也存在着巨大的偏见，比如三分之一以上的孤儿药获批用于肿瘤适应症。
对于肿瘤外的罕见病，转化医学还有很多事可以做。标准技术平台和就绪性的评估机制可能增强患者组织的能力，并促进治疗开发的进展。将罕见病的基础研究转化为治疗方法已成为公共和慈善事业的首要任务。这些事业可以为转化过程提供资金，并为患者群体提供咨询和支持，以使用适当的标准将其研究项目结果转化为治疗方法，这将有助于降低早期研究结果的风险，让更多行业参与推动新疗法。孤儿药开发的商业因素对于大规模市场应用很重要，但是，本文的重点不是孤儿药开发的经济动因或成本，尽管它们可能对孤儿药产生重大影响。针对共有机制同时开发多种罕见病的疗法也可能为高效的转化提供契机，比如药物再发现的增加。单基因罕见病带来了用特异性分子和化学基因组学靶向差异表型的机会。在“可药基因组”的未被研究的地区，也有可能发现罕见病药物。此外，在全球合作中共享诊断数据，同时保护患者的隐私，将有助于更轻松，更快速地诊断罕见病，并促进跨疾病分析。数据统一将减少重复工作和工作成本，并提高效率，增加领域专业知识。传感器技术的提升将提供更多数据，并有利于识别潜在的药物再发现。最后，在具有相似症状的不同疾病建立注册表以及临床和自然史研究时，应咨询患者组，以确保考虑患者的观点。
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