G蛋白偶联受体(G protein–coupledreceptor, GPCRs)是人类基因组中最大的膜蛋白家族，常见的结构特征为七次跨膜(7TM)结构域，可被各种刺激，如光子、离子、神经递质和激素激活，负责将细胞外信号转移到胞浆中，发挥不同的生理作用。超过30%的已批准药物以GPCRs为靶标，它们仍然是药物发现中最成功和最有希望的一类靶标蛋白。
GPCRs与G蛋白结合并水解鸟苷5 ' -三磷酸(GTP)，介导下游信号转导。与GPCRs相关的g蛋白是异三聚体，由三个亚基组成，Gα, Gβ, and Gγ，Gα蛋白：进一步分为Gαs, Gαi/o, Gαq/11, and Gα12/13。根据特定GPCR偶联的G蛋白类型，受体激活可导致特定二级信使，如肌醇三磷酸(Gq)或环腺苷单磷酸(cAMP) (Gs/Gi)。GPCRs在其相关的G蛋白被释放和激活后，G -蛋白偶联受体激酶(GPCR kinases, GRKs)的蛋白激酶家族会磷酸化的细胞内区域，磷酸化的GPCRs会招募β-arrestins, 介导GPCR信号的脱敏、内化，从而起到信号“关闭”的作用，导致G蛋白依赖的GPCR信号的负反馈。β-arrestins不仅是介导G蛋白信号脱敏的蛋白,其本身也具有信号转导的能力，多种介质如增殖蛋白激酶(MAPKs), SRC,核因子-κB (NF -κB)和磷酸肌醇3-kinase (PI3K)。
最初认为，大多数与GPCRs结合的配体具有平衡或不偏的活性，可通过Arrestins和G蛋白途径发出信号；也就是说它们通过两者发出的信号是相等的。然而有些受体配体系统倾向于一个途径而不是另一个途径;也就是说，它们优先通过G蛋白或Arrestins蛋白介导的途径发出信号，偏置配体倾向于一个反应而不是另一个反应, GPCRs的这种信号转导方式称为“偏置信号”（biased signaling）。
而目前关于偏置信号转导的详细分子机制尚不清楚，但已有报道称偏置GPCR配体诱导了一种独特的受体构象，反过来通过结合G蛋白或βaresstin激活一个独特的信号。关于偏置配体稳定的这些构象是什么，以及配体如何稳定的GPCRs采用什么样的特定构象一直未知，阻碍了GPCR偏置信号配体的发现和优化。近日，斯坦福大学的研究人员报道了他们对GPCR偏置信号分子机制的探索发现，此项工作中他们利用大规模的分子动力学模拟研究方法对CPCR偏置信号研究中的经典受体模型—血管紧张素II受体1（AT1R）的Gq和β-arrestin偏置信号的分子机制进行了探索，并根据研究结果设计了Gq和β-arrestin偏置信号特定配体，在体外细胞实验中进行了验证，为GPCR偏置信号研究奠定了基础。
首先他们根据已报到的AT1R与平衡受体（Balance Ligand）—血管紧张素II（AngII）的晶体结构设计进行了5μs的动力模拟，通过分析模拟轨迹发现了AT1R在配体激活后存在两种不同的构象，命名为备选构象（alternative conformation）和经典构象（canonical conformation），通过比对发现二者的主要结构差异位于受体的TM7螺旋的胞内端。
从胞外角度看，从备选构象到经典构象，TM7自脯氨酸扭结上方逆时针翻转，导致TM7胞内部分远离TM2和TM3，导致N1.50（ASN46）将其首选的氢键受体由N7.46（Asn295）到C7.47（Cys296）。构象转变也导致侧链重排：Y7.35和R3.50的侧链在备选构象中指向胞内（向下的），而在经典构象中指向胞外（向上的）。经典构象采取广泛的CPCR活性构象特征，并且与实验上报道的一种CPCR活性结构特征十分相似。虽然没有找到与备选构象十分相似的实验结构，但是在备选构象中的TM7的构象特征与实验上报道的血清素受体2B受体（5-HT2BR）与arrestin偏置配体的复合体结构中的TM7构象十分相似。 通过统计学分析也发现他们所观察到的TM7在两种构象特征也能够与目前所报道的GPCR晶体结构匹配，表明了他们观察到的TM7构象特征的科学存在。研究人员大胆推测两种构象与G蛋白和arrestis信号偶联存在不同，备选构象可能负责arrstins信号偏置。为了验证这个猜想，研究人员首先根据已报到的GPCR-G protein和GPCR-arrestins结构对AT1R的两种构象结构与不同G蛋白和arrstins复合体进行了建模，结果发现，经典构象能够很好地叠合Gq和β-arrestin，而备选构象在叠合Gq蛋白时显示出明显的空间位阻，分析表明AT1R的Gq偏置信号可能主要由经典构象负责，而β-arrestin信号可能主要由备选构象负责。
为了进一步验证，研究人员采用复制交换分子动力模拟(REMD)增加模拟构象交换取样，设计了平衡信号（AngII），Gq偏置信号(TRV055,TRV066)，β-arrestin(TRV023,TRV026,TRV027)偏置信号体系三组模拟体系进行模拟分析，统计学分析表明，与β-arrestin偏置配体结合的TM7比平衡配体更容易采用替代构象，而平衡配体比Gq偏置配体结合的TM7更容易采用替代构象（图7C）。作者综合前文的观察，得出结论arrestin偏置配体通过备选构象达到arrestin信号偏置，而G蛋白偏置配体主要通过经典构象达到偏置信号。
而后，研究人员对配体接合引起TM7胞内端变化的变构网络机制进行了探索，通过模拟分析发现主要有三个区域残基发生重排，耦合信号传递：从备选构象过渡到经典构象过程中，首先是L3.36靠近TM2，N3.35从螺旋束向外翻转（绿色区域）；N3.35的向外位移为F2.53提供了与Y7.43互换位置的空间（橙色区域）；Y7.43的运动导致TM7在其脯氨酸扭结上方扭曲，导致N7.46取代C7.47称为N1.50的氢键伙伴（紫色区域）
研究人员想要根据发现结果设计出诱导AT1R偶联Gq和arrestin信号偏置的配体。于是他们采用力学限制方法使得AT1R胞内端残基保持活性状态，探究配体结合口袋残基的变化来寻找设计思路。通过轨迹分析，他们发现配体口袋中的L3.36与TM2的距离与偏置信号差异有关，平衡信号配体体系比arrestin体系更加频繁地靠近TM2，三个体系中，最靠近TM2的是Gq体系。进一步分析他们发现导致这种差异的主要原因有三点：1）arrestin偏置配体要比其他两个配体延伸到口袋的深度要小得多，AngII和Gq偏置配体在8位（F8）有较大的苯丙氨酸，因此有将L3.36推向TM2的趋势；2）模拟分析表明F8残基苯环的取向与L3.36-TM2的距离有关，当苯环采取垂直取向时，导致L3.36-TM2距离增大，当苯环采取水平取向时，L3.36-TM2距离减小；3）配体2号位残基的带电性影响了苯环取向，同时也会影响结合口袋处TM6的的外移引起偶联Gq信号差异，当2号位的残基为带正电的精氨酸是，其会通过电荷作用使得TM4与TM6螺旋间距离减小，使得F8苯环更倾向于垂于取向。Gq配体上，2号位为非带电氨基酸，使得TM4与TM6间的距离保留足够远，F8苯环倾向于水平取向，TM6呈现出更多的外移比例。
最后，基于模拟分析他们得到了设计偏置信号配体的思路，他们认为当使得F8参加苯环更多时间上保持垂直取向时会有利于arrestin信号偏置，当对2号位氨基酸进行不带电荷氨基酸替换时有利于Gq信号偏置。于是，他们分别对平衡信号配体AngII（全激动剂）和S1I8（部分激动剂）按照以上思路进行了分子改造，通过体外细胞实验发现，所设计的偏置信号配体复合预期设想，对AngII进行取代改造后，能够提高苯环保持垂直取向的比例，进而增加其偶联arrestin的能力。而当将S1I8的2号位氨基酸替换成丙氨酸后，发现其仅在偶联Gq信号的能力上得到提升。综上所述，他们根据自己的分子机制发现较为成功地改造设计出了AT1R不同偏置信号配体，为GPCR偏置信号研究提供了重大帮助。
GPCR信号的研究开辟了一个GPCR-targeted药物发现新时代，在许多情况下，偏置配体的治疗优势已在临床前动物模型或临床试验中得到研究。本项研究工作对偏置信号分子机制的研究奠定了基础。另外，在文末作者也指出，他们的研究中还发现另外两种不同于本文所报道的两种构象，猜测其可能是另外两种负责G蛋白信号偶联的构象。GPCR的构象总体呈现出动态多变的特点，在不同种类间其活性构象也会存在差异，实验报道中也指出其偶联G蛋白和arrestins构象的多元性，因此，针对GPCR偏置信号的探索研究仍然是未完待续的。1. Suomivuori CM, Latorraca NR, Wingler LM, et al. Molecular mechanism of biased signaling in a prototypical G protein-coupled receptor. Science. 2020;367(6480):881-887.
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