【First-in-class药设系列】抗寄生虫病的先导设计与发现
腹泻病占全球儿童总死亡率的9%，每年约有44.6万5岁以下儿童死亡。在撒哈拉以南的非洲和印度次大陆多个地点进行的旨在评估腹泻病负荷及其病因的全面流行病学研究表明，隐孢子虫原虫是幼儿腹泻病和死亡的主要原因；而人类隐孢子虫和小隐孢子虫是人类隐孢子虫感染的主要原因。急性隐孢子虫感染估计每年导致幼儿48,000人死亡，并损失420万伤残调整生命年(DALYs)。隐孢子虫感染还与儿童生长迟缓有关。然而，这种疾病并不局限于低收入国家；尽管有先进的水处理技术，隐孢子虫病在美国和欧洲也很常见。美国半数以上的水传播疾病都是由隐孢子虫引起的，通常与娱乐用水有关，环境中的部分隐孢子虫孢子样卵囊已经对氯化反应具有抗药性。隐孢子虫长期以来也被认为是一种机会性病原体，可导致免疫功能低下的人(如艾滋病毒/艾滋病患者或器官移植受者)受到威胁生命的感染。
目前治疗隐孢子虫病的选择很少，而且没有可用的疫苗。FDA仅批准了一种治疗隐孢子虫病的药物硝唑胺。硝唑胺可适度加速免疫能力个体的康复。然而，对于那些最需要它的病人：营养不良的儿童和免疫功能低下的人，它无法起到治疗效果。最近对隐孢子虫病的全部公共卫生负担的认识，提升了对隐孢子虫病的关注，促进了抗隐孢子虫治疗方法的研发。用现有药物来治疗被忽视的热带疾病隐孢子虫病，可能会降低经济成本。这种方法可以改变现有药物的用途，或者利用现有药物开发项目的化合物和结果来加速被忽视疾病的研究和降低成本。
为了确定新的抗隐孢子虫药物先导和潜在靶点，美国伊利诺斯大学研究人员测试了具有已知作用机制的抗微生物化合物。一共集合了59个具有之前报道的抗菌活性的化合物，使用细胞为基础的高内涵显微镜分析测试作为筛选策略，来评估它们对爱荷华小隐孢子虫株的作用。筛选发现了多种潜在靶点的抑制剂，包括细胞色素bc1复合物、热休克蛋白90 (HSP90)、组蛋白去乙酰化酶(HDACs)、磷脂酰肌醇4-激酶(PI4K)和多种tRNA合成酶。其中，鉴定的最有效的生长抑制剂是双环氮杂环化合物 BRD3914，它对爱荷华Bunch Grass Farm小隐孢子虫株的有效中值浓度(EC50)为62 nM。其原本就是正在开发用于治疗疟疾的双环氮杂环系列，因此可以利用这些抗疟研究中获得的药物化学经验来开发抗隐孢子虫药物。
双环氮杂环系列化合物通过抑制PfcPheRS发挥其抗疟活性，研究人推测BRD3914的抗隐孢子虫活性可能是抑制小隐孢子虫 (C. parvum)的苯丙氨酰- tRNA合成酶 (CpPheRS)的直接结果。研究人员筛选出9种抗恶性疟原虫活性范围从纳摩尔到微摩尔的双环氮杂环类化合物，并对其抗疟原虫活性进行了评估。结果表明，其对恶性疟原虫与小隐孢子虫的抑制活性活性呈正相关(r = 0.883)，表明一种保守的作用机制对这两种寄生虫都起作用。继而，研究人员对双环氮杂环化合物衍生物的抗隐孢子虫活性进行了评估，并在该系列中发现了不同的药代动力学性质的分子(dibasic, BRD7929; zwitterion, BRD3316和monobasic, BRD8494)。这些双环氮杂环化合物显示出广泛的活性，与被测的C. parvum分离株无关，并且对C. hominis和C. parvum具有相当的功效。特别是在1%胎牛血清(FBS)] 的培养条件下，BRD7929对 C. parvum 的EC50 = 9 nM和C. hominis EC50 = 10 nM。
考虑到隐孢子虫病治疗的主要目标人群是2岁以下的儿童，必须满足良好的安全性要求。研究人员评估了这6种化学同系物的细胞毒性，比较C. parvum爱荷华株(1%胎牛血清)的EC50与人回盲腺癌(HCT-8)细胞的半最大细胞毒性浓度(CC50)，观察到所有化合物的选择性指数为>100；特别是，BRD5630的选择性指数可以达到> 10000。
体内实验采用了隐孢子虫病感染模型，利用3 ~ 4周大、刚断奶、严重合并免疫缺陷型(NSG)小鼠，口服小隐孢子虫卵囊(~1 x 105)。采用小隐孢子虫特异性引物对粪便进行定量聚合酶链反应(qPCR)检测。三种强效化合物(BRD7929, BRD3316, BRD3444, C.parvum EC50 <73 nM)及阴性和阳性对照以每24小时50 mg/kg(体重)口服给药，共4天。三种双环氮杂环类化合物治疗后卵囊脱落率均较低(BRD7929的P < 0.05)。特别是，BRD7929显示每毫克粪便的卵囊减少了近3-log。然后，使用相同的免疫缺陷小鼠模型对BRD7929进行了剂量范围研究，给药方案为每24小时给药5, 20, 40 mg/kg，连续4天，检测卵囊脱落率；每24小时给药10mg/kg，连续7天，观察小鼠14天是否感染复发。BRD7929的剂量为每24小时10mg/kg，连续7天，14天后无复发。除了BRD8494外，双环氮杂类药物耐受性良好。在体内测试的八种其他双环丙嗪类药物的体重减轻<5%，并且没有观察到小鼠行为学上的不良影响。
接下来，研究人员检测了这些双环氮杂环类化合物在体内最佳PK/PD关系。隐孢子虫感染的原发部位是肠上皮，这与疟疾不同，疟原虫在肝细胞和红细胞中发育。虽然良好的腔内暴露对体内疗效很重要，但对于治疗隐孢子虫病所需的最佳生物利用度，目前尚无整体共识。减少全身性暴露可提高隐孢子虫病药物的安全性，然而，有一种担忧是，仅在胃肠道暴露可能导致与疾病相关的水样腹泻的药物冲刷，并且可能不是治疗胆道上皮感染的最佳方法。于是，研究人员确定了8种化合物(包括BRD7929、BRD3316和BRD3444)的生物利用度为从1到86%，具有较高生物利用度的类似物(BRD7929、BRD8494和BRD6630)每毫克粪便中卵囊减少量最大。
研究人员基于隐孢子虫的生命周期，使用一系列表型分析进一步在体外研究了BRD7929的抗隐孢子虫作用机制。EdU荧光显微镜检测发现，BRD7929对寄生虫侵袭宿主细胞的过程没有影响，但强烈抑制细胞内寄生虫的发育。通过监测BRD7929在培养的前48小时对无性繁殖的影响，以及性发育生物标志物减数分裂重组蛋白DNA减数分裂重组酶1 (DMC1)的表达情况，比较了BRD7929对小孢子虫性发育的抑制作用和对无性繁殖的抑制作用，48到72小时的培养时间与其他隐孢子虫aaRS抑制剂观察到的一样，BRD7929在两种检测中几乎是等效的，即生长和发育阶段有相同的抑制效果。要想成功治疗艾滋病患者、移植受者和营养不良儿童等免疫缺陷患者，可能需要药物能在缺乏免疫系统大量帮助的情况下迅速消灭寄生虫。感染了C. parvum的NSG小鼠在使用慢效抗隐孢子虫的盘龙霉素和氯法齐明治疗后迅速复发或没有任何改善，但这两种化合物对免疫缺陷较轻的小鼠都有效。与在NSG小鼠模型中观察到的效果一致的是，BRD7929能快速从体外培养中去除C. parvum，在浓度为3×EC90时首次达到最大清除率。在体外，BRD7929对寄生虫的消除呈指数增长，消除99.9%的寄生虫的半数时间为~9.5和~95小时。
此前对恶性疟原虫进行的体外抗性选择实验和全基因组测序发现了PheRS中的点突变，这些突变赋予了对双环氮杂环化合物BRD1095的抗性，尤其是评估小隐孢子虫中内源的482位亮氨酸突变为缬氨酸，是否会获得对BRD7929的抗性。研究人员用这种混合的转基因寄生虫(L482 + V482)或对照(WT L482)，用BRD7929 (10 mg/kg)处理5天(感染后第4至8天)。通过测量粪便中的发光来跟踪寄生虫的脱落情况，发现在药物处理3天后(感染第7天)，两株菌株的荧光素酶活性均有所下降，但混合种群的寄生虫明显反弹。在治疗后的第8天和第11天通过PCR扩增pheRS基因，每天测序8个独立克隆。与输入群体相比，恢复的序列均在核苷酸1444位发生突变，丢失了野生型等位基因，说明该482位突变在BRD7929处理下具有选择优势。
为了进一步确定CpPheRS作为本系列的分子靶标，研究人员纯化了重组ChPheRS蛋白，并测定了其在双环氮杂环化合物作用下的氨基酰化酶的活性。在氨基酰基化反应的第一步，PheRS使用ATP和L-苯丙氨酸形成氨基酰基腺苷酸复合物，释放焦磷酸(PPi)。在第二步，氨基酰基转移到同源tRNA释放AMP。在这里，我们用孔雀石绿吸光度法测定了PPi转化为无机磷酸盐(Pi)后的产量。BRD7929对重组ChPheRS的抑制作用呈浓度依赖性(IC50 = 60 nM)。在此生化试验中观察到的效力与人隐孢子虫试验中观察到的效力相似BRD7929 ChPheRS(1%胎牛血清)EC50 = 10nM，提示抑制ChPheRS完全解释了观察到的细胞效能。ChPheRS对BRD7929的生化效力也与之前报道的PfcPheRS相似(IC50 = 23 nM)，进一步表明了一种保守的作用机制。
本文的研究人员使用老药新用的化合物重定位的方法，节省了新药开发的经济成本，缩短了开发时间，并且结合表型筛选和结构筛选的优点，为被忽视疾病的药物开发提供了良好的新思路。
参考文献：
[1] Vinayak S, Jumani R S, Miller P, et al. Bicyclicazetidines kill the diarrheal pathogen Cryptosporidium in mice by inhibitingparasite phenylalanyl-tRNA synthetase[J]. Science Translational Medicine, 2020,12(563).