【First-in-class药设系列】激酶构象调控揭示远程耐药机制

研究蛋白激酶是通过磷酸化靶蛋白中的酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基的羟基来介导细胞信号转导的关键酶。蛋白激酶具有高度活跃的不同构象状态。通常，在激酶上有三个关键的结构元素决定其是否处于活性状态：Asp-Phe-Gly (DFG) motif，Activation loop和alpha-C helix。当激酶处于完全活化的状态时，DFG motif采取“DFG-in”状态，使Asp指向活性位点，与Mg-ATP形成配位键；A-loop采取“open”状态，便于底物的结合与被磷酸化；alpha-C helix采取“alpha-C-in”状态，其上的Glu可与Lys形成盐桥，与ATP的alpha-、beta-磷酸基团形成配位键。当激酶构象背离上述特征时，会导致其进入失活状态。除此之外，作为直接影响配体与活性位点结合的部分，phosphate-binding loop（P-loop）也是蛋白激酶发挥功能的重要结构域。

    Abl是激酶家族的重要成员，参与调控细胞生长、存活、侵袭、粘附和迁移。BCR和ABL的异常融合使其功能紊乱，导致白血病和其他癌症的发生发展。药物伊马替尼（imatinib）就是通过抑制ABL激酶的活性达到治疗疾病的作用。伊马替尼不仅在成人慢性粒细胞白血病（CML）中取得了显著的成功，有时也可用于治疗儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）。但是，大多数患者会发生突变，产生对伊马替尼和其他抑制剂的耐药性，导致治疗效果较差。尽管目前有可能解释某些突变是如何降低抑制剂的亲和力的，但在远离结合位点的突变影响机制基础尚不清楚。为了回答这一临床科学问题，美国St. Jude儿童研究医院的科研人员使用核磁共振(NMR)光谱从结构上描绘了Abl如何在活性态和两个不同的非活性态之间切换的过程，并解析了Abl如何在不同的突变体、配体、翻译后修饰，抑制剂之间转换构象以实现激酶的不同功能变化。

    首先，研究者采用化学交换饱和转移(CEST)核磁共振技术，发现Abl除了基态（G）外还存在两个不同的激发态（E1和E2）。通过对CEST数据的拟合，他们进一步发现了三个状态间的线性转换关系，G↔E1↔E2。值得注意的是，E1和E2的总占比各为6%，提示两者构象同等稳定。

  当前，Abl尚未获得无配体结合的空结构，已知结构数据均是使用不同抑制剂来捕获的Abl不同构象状态。 基态的Abl构象占有88%的绝对占比，研究者因而解析了这部分无配体的Abl激酶构象，发现其在溶液中主要采取催化活性构象。为了进一步阐明E1 & E2状态是否和抑制剂诱导后的构象存在相关性，他们通过甲基C13化学位移方法进行了解析，发现E1、E2状态分别与Abl结合抑制剂PD173955、Imatinib的构象相似。为了进一步揭示E1、E2构象的特征，他们通过引入突变来更好地富集E1、E2构象。通过大量尝试，他们发现Abl M309L/H415 与Abl M309L/T408Y分别可以提高E1、E2构象的占比，达到50%和90-100%。与Abl完全激活构象对比，E1采取“DFG-out”、alpha-C-in的部分失活状态（如上图B），并将这个E1定义为失活状态1 (I1)；在E2中，其四个关键结构域，A-loop, DFG motif, alpha-C helix, 和P-loop的构象都与之前发现的Abl各种构象不同，呈现完全失活状态（如上图C），定义为失活状态2(I2)。

    imatinib在临床应用中经常会发生突变从而造成耐药。部分突变的作用机制很容易理解，例如，T334I发生在药物结合位点的位置，残基突变后与imatinib形成明显的空间位阻冲突，因而降低其对Abl的亲和力。相比之下，距离imatinib结合位点远端的突变导致耐药机制至今尚未阐明，例如距离抑制剂18埃的H415P突变。他们发现H415P突变造成刚性的脯氨酸骨架二面角受到强制约束，与原来所处的I2状态下A-loop在这个位置的急转不相容，不利于Abl I2构象的稳定，从而造成imatinib的亲和力下降5倍（上图C）；272位的酪氨酸就是稳定I2状态拉伸构象的关键残基，因此Y272H造成的耐药主要是因为His272不能很好地与Glu305形成氢键从而破坏了I2的失活状态；其他E274V（上图F）、F378V（上图G）也是通过使I2构象不能稳定存在而对imatinib产生耐药性。

    除了位点远端区域，蛋白激酶中还存在高度保守的调控(也称为疏水)脊柱区域。在Abl中，Met309, Leu320, His380和Phe401组成了调控脊柱区域。该区域的突变可直接激活或抑制激酶的催化活性。然而，对其潜在的机制也缺乏直接的实验证据。通过核磁技术，他们发现在I1, I2状态下DFG中Phe401向核苷酸结合位点的疏水袋移动，从而成疏水脊断裂，其中I2状态的构象变化比在I1状态更明显。直觉上，具有较高疏水性的残基突变有望促进脊柱的组装，从而诱导其活性状态，但研究者的数据显示并非如此。M309L和L320I的突变虽然是更疏水的残基，但其构象都会趋向失活状态I2（上图B）。所以，很可能除了疏水性外，残基侧链大小、形状和位置在决定脊柱区域的整体稳定性上也是很重要的。这一发现可能解释了为什么调控脊柱区域是各种激酶致癌突变的发生热区。

    此外，尽管DFG motif中Asp残基的突变影响可以用其在催化步骤中的关键作用来解释，但Phe残基的保守性的原因尚不清楚。Abl F401V变体，如NMR数据显示，几乎完全采用（高于95%）I2状态（上图E）。F401V的替换使得DFG从in状态转变为out状态。Abl F401Y变体也以90%的高占比采取I2状态。因此，即使是在这个位置上的保守替代也会影响活跃构象状态和非活跃构象状态的集合，从而导致其功能受损。不同的是，DFG基序中的Phe残基在7%的激酶中可以被Leu取代的形式存在。Abl F401L的核磁共振数据显示，与野生型Abl类似，该变体主要占据活性构象（图4E），这就解释了为什么在这个位置的Leu残基可以被耐受。

    由于A-loop磷酸化在激酶活性调节中的重要作用，研究者定量分析了Abl Tyr412磷酸化对Abl活性态和非活性态构象集合的影响。Tyr412磷酸化后，其非活性状态I1和I2基本消失，只有活性状态被检测到（上图F）。在活性状态下，pTyr412的磷酸基与Arg381和Arg405形成离子对。在I1态下，Tyr412的磷酸化导致Arg405向内翻转，破坏其原本与E311的盐桥作用，从而破坏I1状态，使其大幅减少。Tyr412的侧链在I2状态时位于由Leu403、Leu406和Met407组成的疏水性口袋中。口袋环境排斥带负电荷的pTyr412从而破坏了I2状态的稳定。因此，Tyr412磷酸化后的Abl构象中I1和I2占比极少。

    SH3-SH2调节域与Abl的激酶结构域结合会抑制其活性，但SH3-SH2模块引起的激酶结构域的具体变化机制也尚不清晰。包含SH3-SH2模块和激酶结构域的Abl片段称之为全激酶（AblFK）。在AblFK中，SH3-SH2模块的存在使I2状态的数量增加了近6倍，从6%增加到AblFK的34%。不仅如此，之前被证明能促进组装构象状态的变构抑制剂GNF5，可以增加组装完成的AblFK状态到~95%（上图A）。研究者的数据清楚地证实了SH3-SH2结构域对Abl I2态的变构稳定是其抑制作用的结构基础（上图B）。之前发现H415P取代使I2状态消失，并且增加了I1状态的占比。在Abl结合SH3-SH2的情况下，因为I1态不被SH3-SH2结构域所稳定，H415P突变可使平衡显著地向活性状态转移。这解释了令人费解的发现，即H415P取代刺激Abl激酶活性。同时，即使在GNF5变构抑制剂存在的情况下，T334I的取代也能促进活性状态（上图C）。此外，由于AblFK-T334I主要采用与axitinib选择性靶向一致的构象状态， axitinib可对T334I Abl变体有强10倍的效能（上图D）。A-loop Tyr412位点的磷酸化通过破坏I2状态，抵消了AblFK-GNF5中强烈的自抑制机制（上图E），促进活性状态的构象占比。

    综上，研究数据提示Abl I1构象位于活性和I2状态之间，且I1状态的消耗对I2状态的数量没有影响，因此I1很可能是不必要的中间状态。此外Abl的调控域与激酶的结合所实现的抑制机制，其作用仅在I2状态，而不是在I1状态；突变抑制激酶的DFG-motif通过选择性地稳定I2状态而不是I1来发挥作用。这些证据说明I1状态可能是建立活性和I2状态的演化过程中间产物，并无已知的生物学功能，但它们仍可以用于选择性抑制剂的设计。

参考文献

Tao Xie, Tamjeed Saleh, Paolo Rossi, Charalampos G Kalodimos. Conformational states dynamically populated by a kinase determine its function.  Science. 2020 Oct 9;370(6513):eabc2754. doi: 10.1126/science.abc2754